高产抗生素Zwittermicin A苏云金芽孢杆菌A164发酵条件的优化

从土壤样品中筛选出高产抗生素(Zwittermicin A)的苏云金芽孢杆菌菌株:A164,对此菌种的发酵条件进行了探讨。以A164合成高含量抗生素为目标对发酵培养的碳源、氮源、时间等条件进行了单因素优化;采用Plackett-Burman设计,确定发酵条件的重要影响因子,根据爬坡路径法,确定了各个因子的最适范围,采用响应面分析法对因子再次进行优化,得到了最佳发酵条件。最佳发酵条件为:蛋白胨含量17.56g.L-1,葡萄糖20.0g.L-1,MgSO40.18g.L-1,CaCl20.08g.L-1,ZnSO40.20g.L-1,K2HPO41.3g.L-1,培养温度28.31℃,发酵时间36h。

产Zwittermicin A的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达

通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产生对ZwittermicinA的抗性。

D151阳离子交换树脂吸附Zwittermicin A的动力学研究

[目的]研究阳离子交换树脂对Zwittermicin A的吸附行为。[方法]采用静态吸附法考察了D151阳离子交换树脂对ZwittermicinA的吸附动力学,并对吸附过程中的速控步骤进行研究。[结果]动力学表明,D151阳离子交换树脂对Zwittermicin A的吸附较好的符合了lagergren拟一级动力学模型,吸附的速控步骤是颗粒扩散过程,并推算出交换过程的表观活化能为Ea=16.21 kJ/mol,吸附焓变△H=-17.58 kJ/mol,吸附熵变△S=-12.20 J/(mol.K)。[结论]阳离子交换树脂对Zwittermicin A的吸附过程是自发的放热过程。

D151阳离子交换树脂吸附Zwittermicin A的热力学

采用静态吸附法研究了D151阳离子交换树脂对Zwittermicin A的吸附过程的热力学性质。结果表明,在温度288、298和318 K和研究的浓度范围内,Zwittermicin A在D151阳离子交换树脂上吸附等温线均符合Freundlich吸附等温线方程。热力学参数表明,吸附过程是自发的、放热的优惠型吸附。

Zwittermicin A的分离纯化及其稳定性的初步研究

通过离子交换法,用D113树脂对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种D1-23发酵液进行初步提纯,经HPLC-MS纯化和制备,得到2.89mg Zwittermicin A纯品。离子交换第1次冲洗液NH4H2PO4的最适浓度为5mmol/L;第2次冲洗液CH3COONH4的最适浓度为30mmol/L,梯度冲洗pH值为8.0～9.5;Zwittermicin A的总收得率达93%。Zwittermicin A的热稳定性和pH值稳定性实验表明,Zwittermicin A在100℃下的半衰期为48.22min;在pH值3.0～12.0范围内pH值越低,Zwittermicin A的稳定性越强。

Zwittermicin A合成基因簇中腺苷酰化功能域的预测、表达与活性验证

【目的】腺苷酰化功能域为非核糖体肽合成反应第一步底物活化的必需酶,本研究目的为验证2,3-二氨基丙酸是Zwittermicin A生物合成的直接前体物之一。【方法】本研究通过PCR的方法从苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520的Zwittermicin A合成基因簇中扩增得到一腺苷酰化功能域,经过双酶切和亚克隆,将此功能域克隆至超量表达载体pGEX-6p-1,将此功能域构建重组质粒pBMB1312;采用不同的IPTG浓度和温度梯度对其进行诱导,摸索了该功能域在大肠杆菌中超量表达纯化的最佳条件。【结果】得出在20℃,0.1mmol/L IPTG,宿主菌为BL21 codon plus RP(DE3)的条件下,该功能域可以被有效纯化。同时,焦磷酸释放实验证实该功能域可以对Zwittermicin A的假想前体物2,3-二氨基丙酸进行腺苷酰化。【结论】进一步支持了2,3-二氨基丙酸是Zwittermicin A生物合成的直接前体物之一的假设。

豆粕的不同酶解液发酵苏云金芽孢杆菌对Zwittermicin A产量的影响

目的研究培养基中豆粕所含蛋白质的不同存在形式对zwittermicin A产量的影响。方法豆粕经过3种不同的复合蛋白酶(碱/中蛋白酶、中性蛋白酶、酸/中蛋白酶)处理后形成了蛋白质、寡肽和氨基酸含量均不同的3种酶解液,即DP1,DP2和DP3。以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis sp.kurstaki D1-23)为菌种,分别将这3种豆粕酶解液作为其氮源进行发酵。结果从含有DP1的培养基D-1中获得的苏云金芽孢杆菌生物量最低;含有DP2的培养基D-2中的zwittermicin A含量最高;从含有DP3的培养基D-3中得到的生物量最大。结论氮源的存在形式不同,对Bacillus thuringiensis sp.turstaki D1-23菌体繁殖和其次级代谢产物zwittermicin A的合成有不同影响。

Zwitternicin A晶体生成习性预测研究

通过重结晶方法,选用不同的溶剂获得了Zwittermicin A晶型A和晶型B,利用红外光谱法(IR)、X-射线粉末衍射分析法(XRD)和熔点法等对Zwittermicin A各晶型物进行了鉴定与表征。同时利用Materials Studio 4.2软件对Zwittermicin A两种晶型物分子进行晶体结构模拟研究,确定二种晶型的晶胞参数和空间群;通过Morphology模块中的BDFH模型,研究了Zwittermicin A各晶型的理论预测晶习,并通过Growth morphology模块研究Zwittermicin A各晶型的主要生长面,初步探讨各晶型晶习形成机理。

苏云金杆菌发酵上清液中生物活性物质的研究

对苏云金芽胞杆菌MP-342发酵上清液中生物活性物质的抑菌作用及化学结构进行初步研究。经717树脂脱色和732树脂吸附、氨水洗脱、真空浓缩及冷冻干燥,得到了纯度较高的精制品。然后进行了抑菌活性试验,结果表明该物质对苹果轮纹菌(Dothiorella gregaria)和苹果褐斑病菌(Marssonin mali)等植物病害微生物有明显的抑菌作用。最后通过质谱分析,表明该活性物质的分子量为396,推测该物质与国外文献报道的zwittermicin A可能为同一物质。