人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达

目的拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)A亚单位蛋白。方法将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入sf9昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度。最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件。结果在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性。将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1代病毒的滴度为2×10^(7) pfu/m。蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为55 ku,主要在培养基中。蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1,最佳感染时程为72 h。结论本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功的糖基化修饰。该系统为其工业化平台的建设及生产提供前期基础,也针对日后TSHR蛋白的研究和Graves病的病因预防提供了有用的工具。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因工程菌的发酵

目的 研究幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）基因工程菌的发酵工艺。方法 通过不同培 养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位基因工程菌的菌体生长与 外源蛋白表达量的影响的比较，确定其较为合适的培养条件。结果 多批实验证明，菌体单产可达４２ｇ／Ｌ，目的蛋 白的表达率为３８．５％。结论 此发酵工艺可以提高ＨｓｐＡ基因工程菌菌体的得率和目的蛋白的表达。

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因的多样性分析

根据已经发表的大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位(FedA/ab)的基因序列(fedA/ab)设计1对引物,利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒TF107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12FA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定,并与已发表的fedA/ab进行比较、基因树分析,可将这10个菌株分为2个基因群,其中F107/86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedA/ab具有高度同源性,属于fedA/ab,大小为513bp;E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支,属于fedA/ac,大小为516bp。

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因(fedA)的克隆与序列测定

利用PCR技术 ,分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌 8813株中扩增出 5 10bp左右的F18菌毛A亚单位基因 (fedA)。将这 2个PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX 6p 1载体的谷胱甘肽S 转移酶 (GST)基因的下游 ,筛选获得阳性重组质粒 ,并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明 :F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为 97.6 % ,推导的氨基酸序列同源性为 94.7% ,两者的主要区别在于F18acfedA基因的第 36 3bp处比F18ab多 3个核苷酸 ,并出现一个新的酶切位点 (NgoMI)

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位及酶活性部位的基因缺失、突变株表达产物免疫生物学特性

重组志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位pGEX＿Ansp及其酶活性部位的基因缺失株pGEX＿Ade及突变株pGEX＿Amu转化的大肠杆菌经诱导后,表达产物经超声波裂解并滤过除菌。ICR小鼠腹腔注射三种重组质粒转化菌诱导后菌体裂解物的除菌滤液,以检验重组表达产物的毒性和免疫原性;在Vero细胞上检测重组菌表达产物对Vero细胞的半数致死量(CD50)及免疫鼠血清对SLT＿Ⅱe毒素的中和实验三方面来比较pGEX＿Ansp、pGEX＿Ade和pGEX＿Amu的生物学特性,结果表明这三种基因工程菌表达产物经腹腔注射后可以诱导机体产生一定程度的保护性抗体。在Vero细胞上,pGEX＿Ansp的表达产物可在一定程度上使Vero细胞产生细胞病变,pGEX＿Amu的表达产物可在一定程度上抑制Vero细胞单层形成时间,而pGEX＿Ade对Vero细胞的生长无影响。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析,为H.pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEL-HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因,通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0.35kb的hspA基因片段,特异PCR可扩增出hspA基因片段,证实H.pylorihspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序,国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号:AY295084),编码由118个氨基酸残基组成的肽链,hspA基因序列与GenBank公布的H.pylori相应基因同源性高达95.20％-97.48％,氨基酸序列同源性在95.76％-97.46％之间。结论 克隆了H.pylori菌株MEL-HP27的hspA基因,其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97.48％。

F18ac菌毛A亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位 (FedA/ab)的基因 (fedA/ab) [1] ,设计一对引物 ,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌 2 134P株[2 ] 、8199株[3 ] 、8813株[3 ] 中分别扩增到一段序列 ,并克隆至 pGEM_T载体 ,获得重组质粒T2 134PA、T8199A、T8813A。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明 ,该 3个序列大小均为 5 16bp ,与fedA/ab(5 13bp)具有较高的同源性 ,分别为 96 3%、96 5 %、95 9% ,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为 93 0 %、93 6 %、92 4 %。数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位 (FedA/ac)的基因 (fedA/ac)。

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺杆菌的热休克蛋白A基因 (hspA) ,并对其初步纯化。 方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后 ,克隆于表达载体 pIM 1中 ,转化大肠杆菌。以SDS PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达 ,并测定N 端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析 ,对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为 35 7bp ,并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的 6 0 .5 %。免疫印迹及氨基酸测序结果证实 ,表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为 87.8%。结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化 。

NMDA受体NR2A亚单位C末端突变体在HEK293细胞的共表达研究

目的 :研究 N-甲基 - D-天冬氨酸 (NMDA)受体 NR2 A亚单位的细胞内羧基端在受体装配和表面表达中的作用。方法 :构建 N末端 GFP标记、C末端不同区域缺失的 NR2 A亚单位表达载体 GFP- NR2 AΔ C1～ GFP- NR2 AΔC5 ,其 C末端缺失区依次分别为 897L - 10 17S、10 2 4 D- 114 2 P、114 9D- 1347G、135 4S- 14 6 4V和 897L - 14 6 4V。将它们单独转染或与 NR1亚单位共转染到 HEK2 93细胞 ,用抗 GFP多克隆抗体和 Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色。结果 :成功构建了 5个 C末端不同区域缺失的 GFP- NR2 A表达质粒 GFP- NR2 AΔC1～ GFP- NR2 AΔC5。将这些载体分别单独转染 HEK2 93细胞 ,均不能获得达细胞膜表面表达。而将这些质粒分别与 NR1- 1a共转染 HEK2 93细胞 ,发现它们均能与 NR1- 1a表达于细胞膜表面。结论 :NR1- 1a与 NR2 A的共表达是形成NR1- 1a/ NR2 A亚型 NMDA受体并获得细胞表面表达的必要条件。NR2 A C末端 897L下游并未找到直接与 NR1- 1a C1盒中内质网滞留基序相互作用的某一特定区域 ,也不含有决定 NR2 A亚单位本身细胞内滞留的区域。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的 获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位 (HspA)的融合蛋白。方法 PCR扩增ltB和hspA基因 ,依次构建至表达载体pIM 1,转化大肠杆菌 ,SDS PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1 ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测重组LTB HspA融合蛋白LTB组分与GM1 神经节苷脂结合活性。结果 重组LTB HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的 2 5 %。免疫印迹检测结果证实为重组LTB HspA融合蛋白。GM1ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB HspA融合蛋白具有与GM1 神经节苷脂结合的活性。结论 LTB HspA融合蛋白的表达研究 。

肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素A亚单位单克隆抗体S1D8的制备和初步应用

目的:制备肠出血性大肠杆菌(EHEC)Ⅱ型志贺毒素(StxⅡ)A亚单位单克隆抗体,探讨用特异性抗体检测EHEC志贺毒素的可行性。方法:通过基因工程操作制备了EHEC StxⅡA亚单位蛋白-StxⅡA,StxⅡA免疫小鼠制备鼠源单克隆抗体;对获得的抗体S1D8克隆的特异性用Western blot验证;最后用单抗S1D8制备亲和层析柱纯化StxⅡ,用志贺毒素检测试剂盒验证其特异性。结果:成功表达、纯化StxⅡA-GST融合蛋白;从融和的杂交瘤中筛选出一株特异性抗体克隆并命名为S1D8,S1D8在Western blot中可以与StxⅡ的A亚单位特异性结合,用S1D8亲和层析柱从EHEC的培养上清液中纯化了StxⅡ,在胶体金检测试验中StxⅡ阳性。结论:单克隆抗体S1D8的制备为基于毒素分子作为靶分子的EHEC免疫诊断、治疗研究奠定了基础。

NR2A亚单位C末端的部分缺失对NMDA受体功能和表达的影响

目的研究NMDA受体NR2A亚单位羧基末端(以下简称为C末端)不同部位缺失对该受体表面表达和功能的影响。方法以GFP-NR2A为起始质粒构建了4个依次缺失部分C末端的GFP标记的NR2A亚单位表达载体:NR2A-ΔC1(缺失897L至1017S)、NR2A-ΔC2(缺失1024D至1142P)、NR2A-ΔC3(缺失1149D至1347G)及NR2A-ΔC4(缺失1354S至1464V);通过活细胞免疫化学染色分析这些载体与NR1-1a亚单位共转染后在HEK293细胞和海马神经元的表面表达,并通过电生理检测转染HEK293细胞NMDA受体的功能。结果当NR2A-ΔC1、NR2A-ΔC2、NR2AΔC3、NR2A-ΔC4分别与NR1-1a共转染HEK293细胞时,均可获得细胞膜表面表达,其表面染色阳性的细胞在绿色荧光蛋白细胞中的百分比与共转染NR1-1a/GFP-NR2A时的百分比相比均无显著性降低;并且NR1-1a/NR2A-ΔC2或NR1-1a/NR2A-ΔC4转染的HEK293细胞均能记录到谷氨酸诱发的NMDA受体通道电流。在海马神经元中,当转染NR2A-ΔC1、NR2A-ΔC2或NR2A-ΔC3时,单位长度树突表面表达的受体簇数量均显著低于转染GFP-NR2A的神经元,而转染NR2A-ΔC4的树突表面表达的受体簇数量却无显著性降低。结论在HEK293细胞中,C末端部分缺失的NR2A亚单位不影响含NR2A亚单位的NMDA受体在膜表面表达;而在海马神经元中,含NR2A的NMDA受体的表面表达数量受NR2AC末端的调控。

NMDA受体NR2A亚单位在凝血酶诱导的大鼠脑出血后脑损伤作用机制的研究

目的探讨N-甲基-D天冬氨酸受体(NMDA)受体NR2A亚单位在凝血酶诱导的大鼠脑出血后脑损伤中的作用机制。方法将健康雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组、凝血酶组、凝血酶+阿加曲班组,建立大鼠脑出血模型。造模后48h,采用伊文思蓝法检测血脑屏障(BBB)的通透性,干-湿重法测脑组织的含水量。采用Western-blot方法观察出血后各时间点(0h、0.5h、6h、24h、72h、120h)血肿周围脑组织NR2A分布及动态变化规律。结果 (1)阿加曲班可以明显改善大鼠脑出血BBB通透性(P<0.05),血肿周围脑水肿明显减轻(P<0.05)。(2)Western-blot结果显示,NR2A在6h时开始增加,72h达到高峰,在120h时基本恢复。阿加曲班可以明显减少NR2A在72h时的表达(P<0.05)。结论 (1)NR2A参与了凝血酶诱导的脑出血后脑损伤的病理生理过程。(2)凝血酶可能通过上调NR2A表达引起脑出血后脑组织的损伤。

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第 2 98～ 80 5序列、818～ 12 0 1序列进行了扩增 ,使其第 80 6～ 817序列的碱基 (编码 16 7～ 170位氨基酸 )缺失 ,并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX 6P 1中 ,获得了含有重组质粒 pGEX Ade的重组大肠埃希氏菌 ;经SDS PAGE以及使用特异性抗SLT ⅡeA单克隆抗体的Western blotting ,证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT ⅡeA。

成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

根据G enB ank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列,设计合成了2对引物,分别进行PCR扩增,将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM-TA2。用B amHⅠ和K pnⅠ以及B amHⅠ和X hoⅠ双酶切pGEM-TA1和pGEM-TA2,均得到大小为895 bp的ShT-A基因片段,分别与pQE 30和pET 21a(+)原核重组表达载体连接,构建pQE 30-A2和pET-21A1原核重组表达质粒。工程菌M 15/pQE 30-A 2和BL-21/pET-21A 1经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E.coli细胞产生毒性作用。DNA s is软件分析ShT-A基因序列,发现在513 bp处有H indⅢ位点,以ShT-A上游引物的B amHⅠ和H indⅢ从pGEM-TA1切出1个513 bp的截短片段,重新插入表达载体pQE 30,经PCR和双酶切鉴定正确后,得到pQE 30-A513重组表达质粒,转化E.coliM 15经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 000处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析,该截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37.4%,主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明,表达的重组ShT-A513蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。

NMDA受体2A亚单位mRNA和蛋白质在大鼠海马前脑缺血再灌注损伤中的变化

目的观察分析大鼠前脑缺血再灌注早期,NMDA受体2A亚单位mRNA和蛋白质表达的改变,探讨两者在缺血性脑损伤中的变化和相互关系。方法选择SD大鼠30只,随机为分正常对照组(NC组)6只,假手术对照组(SC组)12只,缺血再藻注组(IR组)12只,大鼠脑8μm厚石蜡切片,原位杂交染色,TUNEL染色,焦油紫染色。图像和镜下分析。结果 (1)NR2AmRNA在海马的CA1区缺血24h后,显著高于NC组水平,是SC组的141.5%(P<0.01)。(2)NR2A蛋白质水平在海马的CA1区缺血复灌48h后,显著下降,是SC组的59.3%(P<0.01)。结论缺血性脑损伤早期中,NMDA受体2A亚单位mRNA和蛋白质表达并不呈现一致变化,提示缺血过程中2A亚单位的转录水平未受影响,而翻译水平受到了干扰。

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以 Eco RⅠ和 Bam HⅠ将腺相关病毒骨架质粒 pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%~94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10^13 vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的 hTSHR289 蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒体内外表达研究

目的探讨人TSHR A亚单位重组腺相关病毒(rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen)能否在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠体内表达及其表达效率。方法以rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染NIH3T3,Western blotting检测目的基因蛋白表达;分别以不同剂量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen注射雌性BALB/c小鼠,免疫荧光法检测TSHR A亚单位蛋白在各个器官的表达,免疫放射法测定血清TSHR抗体(TRAb)滴度。结果感染rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreenNIH3T3细胞48 h及72 h后均有目的蛋白表达,与24 h相比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜下可见腿部骨骼肌、心肌、肝脏、脾脏有不同程度的TSHR289表达;放免法测定结果显示,注射剂量越大,血清TRAb抗体滴度越高,但只有高剂量和对照组之间有统计学差异(P<0.05)。中剂量和高剂量肌内注射在第4、8、12周小鼠体内均有抗体反应,但以第4周最强,4~8周逐渐减弱,抗体持续时间可达12周。结论rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen可在体外及小鼠体内高效表达,并具有较强免疫原性,可能成为制备Graves病模型的一种重要手段。