依托咪酯调节AMPK/NLRP3信号通路对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

目的探究依托咪酯调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤的影响。方法取SD大鼠通过结扎左冠状动脉前降支建立AMI模型,随机分为模型组、依托咪酯组、Dorsomorphin组、依托咪酯+Dorsomorphin组,每组12只,另取12只大鼠作为假手术组开胸后不结扎,分组处理后检测各组大鼠心功能、心肌组织病理损伤及纤维化、血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)水平、心肌组织IL-1β、IL-6、SOD与MDA水平、心肌组织AMPK/NLRP3通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织呈严重病理损伤,左室舒张末期内径(LVDD)、左室收缩末期内径(LVDS)、心肌胶原容积分数(CVF)、血清LDH、CPK、IL-1β及IL-6水平、心肌组织IL-1β、IL-6及MDA水平、心肌组织NLRP3蛋白表达明显升高(P<0.05),左室射血分数(EF)、血清及心肌组织SOD水平、心肌组织p-AMPK/AMPK明显降低(P<0.05)。与模型组相比,依托咪酯组大鼠心肌组织病理损伤减轻,LVDD、LVDS、心肌CVF、血清LDH、CPK、IL-1β及IL-6水平、心肌组织IL-1β、IL-6及MDA水平、心肌组织NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),EF、血清及心肌组织SOD水平、心肌组织p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);Dorsomorphin组大鼠各指标变化趋势与依托咪酯组相反,且Dorsomorphin可减弱依托咪酯对模型组大鼠各指标的作用。结论依托咪酯可通过调控AMPK/NLRP3信号传导而抑制AMI后炎症与氧化应激反应,进而减轻AMI大鼠心肌组织损伤及纤维化,改善其心功能。

基于AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路研究补阳还五汤促进骨质疏松性骨折大鼠愈合的机制

目的基于AMP活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子(sirt)1/核转录因子(NF)-κB受体活化蛋白配体(RANKL)/骨保护素(OPG)信号通路,探究补阳还五汤促进骨质疏松性骨折大鼠骨折愈合的机制。方法将大鼠随机分成假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组(6.25 g/kg)、补阳还五汤中剂量组(12.50 g/kg)和补阳还五汤高剂量组(25.00 g/kg)。除假手术组外,其余组均构建骨质疏松性骨折模型,并给予相应剂量药物干预。检测大鼠骨密度(BMD)值、骨折愈合评分及骨痂体积;自动生化分析仪测定血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素、钙和磷水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测股骨组织中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠骨痂组织的病理形态;Western印迹检测股骨组织中AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组骨痂骨小梁分布稀疏,成骨细胞大量减少且有纤维组织生成,骨痂体积、血清中ALP、骨钙素、钙和磷水平及股骨组织中MDA水平、RANKL蛋白水平显著升高(P<0.05),BMD值、骨折愈合评分、骨组织中SOD和GSH-Px水平和AMPK、sirt1、OPG蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,补阳还五汤低、中、高剂量组骨痂骨小梁分布较为密集,成骨细胞增加,骨痂体积、血清中ALP、骨钙素、钙和磷水平及股骨组织中MDA水平、RANKL蛋白水平显著降低(P<0.05),BMD值、骨折愈合评分、骨组织中SOD和GSH-Px水平和AMPK、sirt1、OPG蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论补阳还五汤可能通过抑制氧化应激反应,调节AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路,发挥对骨质疏松骨折大鼠的治疗作用。

益肾健骨丸对KOA软骨细胞AMPK/Cyclin Y/CDK16通路活性及细胞自噬的影响

目的 探讨益肾健骨丸对膝骨关节炎(KOA)软骨细胞AMPK/Cyclin Y/CDK16通路活性及自噬的影响。方法 在接受人工全膝关节置换术KOA患者软骨组织中提取软骨细胞,筛选最佳给药浓度及时间后,将其分成模型组(Modle)、对照组(Control)、AMPK激活剂组(AICAR)、AMPK抑制剂组(Compound C)、益肾健骨丸组(YSJGP)和AMPK抑制剂+益肾健骨丸组(Compound C+YSJGP),除模型组、对照组外,其余各组给予相对应的药物干预。使用CCK8法检测益肾健骨丸对软骨细胞活性的影响,qRT-PCR和Western blot检测软骨细胞中AMPK、Cyclin Y、CDK16 mRNA和蛋白表达以及ULK-1、Beclin 1、p62 mRNA和蛋白的表达及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,使用透射电镜观察自噬小体,并利用激光共聚焦观察LC3Ⅱ蛋白相对表达。结果 YSJGP可显著提升LPS诱导的软骨细胞中AMPK/Cyclin Y/CDK16通路活性,增加ULK-1、Beclin 1的活性及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,减少p62的表达,并可增加软骨细胞中自噬小体的数量及LC3Ⅱ的荧光强度,其对软骨细胞的影响与AICAR趋势一致,而Compound C干预则与之相反;此外,Compound C还显著抑制了YSJGP对AMPK/Cyclin Y/CDK16通路活性及ULK-1、Beclin 1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ的调节,逆转了YSJGP对软骨细胞自噬活性的调控作用。结论 益肾健骨丸能提升KOA软骨细胞自噬活性,其机制与上调AMPK/Cyclin Y/CDK16通路活性密切相关。

miR-155/瘦素受体/AMPK轴在结核菌素诱导破骨细胞形成中的作用及机制

背景:破骨细胞异常活化在脊柱结核骨质破坏中起重要作用。在骨质疏松发病过程中,敲低miR-155通过增加瘦素受体的表达来激活磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase,AMPK),进而抑制破骨细胞分化及骨吸收。但miR-155/瘦素受体/AMPK轴在脊柱结核骨质破坏中的作用尚不清楚。目的:研究miR-155/瘦素受体/AMPK轴在结核菌素诱导破骨细胞形成中的作用及机制。方法:培养单核巨噬细胞RAW264.7细胞,用不同浓度(1.0,2.5,5.0,10.0 IU/mL)结核菌素处理,转染阴性对照序列或miR-155抑制物、阴性对照siRNA序列或瘦素受体siRNA序列。采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞数量,荧光定量PCR检测miR-155 mRNA表达,Western blot检测瘦素受体、p-AMPK蛋白表达,双荧光素酶报告基因验证miR-155靶向瘦素受体。结果与结论:①与对照组比较,2.5,5.0,10.0 IU/mL结核菌素组破骨细胞数量、miR-155 mRNA表达水平明显增加,瘦素受体、p-AMPK蛋白表达水平明显降低(P<0.05);②与阴性对照+5.0 IU/mL结核菌素组比较,miR-155抑制物+5.0 IU/mL结核菌素组破骨细胞数量、miR-155 mRNA表达水平明显降低,瘦素受体、p-AMPK蛋白表达水平明显增加(P<0.05);③与阴性对照组比较,miR-155抑制物组瘦素受体野生型双荧光素酶报告基因的荧光活力增加,miR-155模拟物组瘦素受体野生型双荧光素酶报告基因的荧光活力降低(P<0.05);④与阴性对照siRNA+miR-155抑制物+5.0 IU/mL结核菌素组比较,瘦素受体siRNA+miR-155抑制物+5.0 IU/mL结核菌素组miR-155 mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),破骨细胞数量明显增加,瘦素受体、p-AMPK蛋白表达水平明显降低(P<0.05);⑤结果表明,结核菌素通过增加miR-155表达抑制下游瘦素受体表达及AMPK激活,进而诱导破骨细胞形成。

三丁酸甘油酯通过调节AMPK/mTOR通路改善鸡白痢沙门氏菌诱导的肝脏炎症

为探讨三丁酸甘油酯(TB)对鸡白痢沙门氏菌(SP)诱导的肝脏炎症调控机制,试验将128只1日龄健康、体重相近的海南文昌鸡随机分为对照组(Con组)、SP模型组(Mod组)、SP+恩诺沙星抗生素组(Ant组)、SP+三丁酸甘油酯组(Tre组),每组4个重复,每个重复8只。试验比较了各组雏鸡的生长性能,并通过血液生化检测、肝脏HE染色、荧光实时定量PCR和免疫组化等方法探究TB对SP所致肝脏炎症的影响及其调控机制。结果显示:①Ant组和Tre组平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和存活率均显著高于Mod组(P<0.05);②Ant组和Tre组γ-谷氨酰转移酶(GGT)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性和总胆红素(TBIL)含量显著低于Mod组(P<0.05),白蛋白(ALB)水平显著高于Mod组(P<0.05);③与Con组相比,Ant组肝脏细胞形态完整,有少量炎性细胞,Tre组肝脏细胞形态较完整,伴有少量炎性细胞浸润;④Ant组和Tre组促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达水平较Mod组显著降低(P<0.05),而白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达水平较Mod组显著升高(P<0.05);⑤恩诺沙星和TB可通过AMPK/mTOR和NF-κB通路减轻SP感染对雏鸡肝脏损伤的影响。研究表明,饲粮添加TB可显著提高SP感染雏鸡的生长性能,降低部分血液生化指标,可能通过AMPK/mTOR通路减轻SP所致的肝脏损伤,并减少促炎因子的表达以减缓肝脏炎症。

阿江榄仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信号通路调控自噬对糖尿病视网膜病变影响

目的探讨阿江榄仁酸(arjunolic acid,AA)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜细胞自噬及AMPK/mTOR/HO-1信号通路的影响。方法以健康SD大鼠为研究对象,构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为对照组(Con)组、模型(STZ)组、AA低剂量(AAL,10 mg/kg)组和AA高剂量(AAH,10 mg/kg)组。连续给药10周后,HE染色检测视网膜组织病理结构;qRT-PCR检测视网膜组织白介素(IL)-1β、IL-6和线粒体丙酮酸转运载体(MPC)-1的mRNA表达;二氢乙锭(DHE)染色评估视网膜组织ROS产生;Western blot检测自噬和AMPK/mTOR/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果与Con组比较,STZ组大鼠视网膜出现肿胀和空泡样变化等病理变化,中央视网膜ONL层厚度和细胞核计数明显降低(P<0.01);IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著增高(P<0.05);视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中ROS产生增加(P<0.01);LC3II/I比率、HO-1和p-AMPK/AMPK蛋白表达显著降低,p62和p-mTOR/mTOR表达升高(P<0.01)。与STZ组比较,AAL和AAH组大鼠视网膜ONL厚度和细胞核计数逐渐升高,结构相对规整(P<0.05);AAH组IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显降低(P<0.05);视网膜ONL、INL和GCL中ROS产生逐渐降低(P<0.01);LC3II/I比率、p-AMPK/AMPK和HO-1表达逐渐升高,p62和p-mTOR/mTOR表达逐渐降低(P<0.01)。结论阿江榄仁酸可能是治疗DR的候选药物,可能机制为通过AMPK/mTOR/HO-1调节的自噬途径保护视网膜细胞免受STZ诱导的氧化应激和炎症损伤。

青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

PHPS1通过调控口腔鳞状细胞癌内ROS/SHP-2/AMPK活性促进PD-L1丝氨酸磷酸化进而加速肿瘤凋亡

目的探讨PHPS1通过对口腔鳞状细胞癌细胞ROS/酪氨酸磷酸酶SHP-2/AMPK活性进而促进PD-L1丝氨酸磷酸化进而加速肿瘤凋亡的机制研究,分析腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对于低氧环境下肿瘤内血管生成的影响。方法6~8周龄健康裸鼠16只,皮下移植瘤模型分为Control组和PHPS1组,8只/组,培育14 d后观察肿瘤的生长情况,并将其切片进行HE染色固定并拍照。将人口腔鳞状细胞癌Ca9-22细胞系培养后分为Control组、PHPS1组、Control+Compound C组(Compound C为AMPK抑制剂)、PHPS1+Compound C组在1%低氧环境下培养,通过Western blotting对细胞内SHP-2、AMPK、HIF-1α、PD-L1、caspase-8、caspase-3和BAX含量进行检测。结果裸鼠成瘤与血管新生实验结果显示PHPS1抑制了裸鼠体内肿瘤生长和血管新生(P<0.05)。Western blotting分析显示PHPS1降低了SHP-2、HIF-1α、PD-L1、ERK2、STAT3和VEGF的表达,同时增加了AMPK的表达(P<0.05)。加入AMPK抑制剂后,PHPS1对HIF-1α和PD-L1的抑制作用减弱(P<0.05)。此外,PHPS1促进了caspase-3、caspase-8、PD-L1 S195磷酸化和Bax蛋白的表达,这些效应在加入AMPK抑制剂后也有所减弱(P<0.05)。HE染色结果表明PHPS1组肿瘤血管生成数量减少(P<0.01)。结论在缺氧环境下可以通过调节SHP-2/AMPK活性进而促进PD-L1丝氨酸磷酸化进而加速肿瘤凋亡。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

ACSL4通过AMPK/mTOR通路抑制七氟醚诱导神经元铁死亡机制的实验研究

目的探讨酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA syntbetase long chain family member 4,ACSL4)在七氟醚(sevoflurane,Sev)诱导的神经元细胞损伤中的作用及机制。方法以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为研究对象,分别设置对照组(二甲基亚砜,10μmol/L)、Sev组和Sev+铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1,10μmol/L)组,采用CCK-8法检测细胞活性。体外构建4.1%Sev暴露的术后认知功能障碍模型,按照转染类别分为Ctrol组、Sev组、Sev+si-NC组、Sev+si-ACSL4组和Sev+si-ACSL4+compound C组。采用比色法检测各组细胞中丙二醛(malonaldehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和Fe2+含量;2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测活性氧水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ACSL4,谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)mRNA表达;蛋白免疫印迹法(WB)检测ACSL4,GPX4,腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化(phosphorylated,p)-AMPK,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin)mTOR和p-mTOR蛋白表达。结果CCK-8结果显示,Sev组细胞活力(0.41±0.11)较对照组(0.98±0.07)明显降低,Sev+Fer-1组细胞活力(0.83±0.09)较Sev组显著升高,差异具有统计学意义(t=7.572,5.118,均P<0.01)。Sev组细胞中Fe2+,MDA,4-HNE,ROS水平和p-AMPK/AMPK比率以及ACSL4的mRNA和蛋白表达高于Ctrol组(t=5.900,7.421,4.795,13.517,10.825,9.945,11.334),GSH,p-mTOR/mTOR比率以及SLC7A11,GPX4的mRNA和蛋白表达低于Ctrol组(t=20.438,3.551,11.460,12.211,6.845,8.287),差异具有统计学意义(均P<0.05)。Sev+siACSL4组Fe2+,MDA,4-HNE,ROS水平和p-AMPK/AMPK比率以及ACSL4的mRNA和蛋白表达低于Sev+siNC组(t=3.818,3.164,3.054,4.465,13.088,7.918,9.737),细胞活力、GSH含量、p-mTOR/mTOR比率以及SLC7A11,GPX4的蛋白表达高于Sev+si-NC组(t=2.912,7.248,7.574,20.092,5.915),差异具有统计学意义(均P<0.05)。Sev+si-ACSL4+compound C组细胞活力、GSH含量和SLC7A11,GPX4蛋白表达低于Sev+si-ACSL4组(t=4.435,8.521,4.522,8.767),而Fe2+,MDA,4-HNE和ROS水平高于Sev+si-ACSL4组(t=10.046,4.004,2.957,3.752),差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论抑制ACSL4表达可通过激活AMPK/mTOR信号通路减轻Sev诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡。

基于AMPK/PGC1α信号通路探究降脂逐瘀汤对动脉粥样硬化大鼠脂代谢的影响

目的:基于AMPK/PGC1α信号通路探究降脂逐瘀汤对动脉粥样硬化(AS)大鼠脂代谢的影响。方法:高脂饲料喂养及腹腔注射维生素D3诱导建立AS大鼠模型,随机分为模型组、降脂逐瘀汤(3.75 g/kg)低剂量组、降脂逐瘀汤(7.5 g/kg)中剂量组、降脂逐瘀汤(15 g/kg)高剂量组、降脂逐瘀汤(15 g/kg)高剂量+盐酸多索啡(AMPK抑制剂,0.2 mg/kg)组,每组12只,另取12只正常SD大鼠喂养普通饮食及腹腔注射生理盐水作为对照组。经降脂逐瘀汤和盐酸多索啡分组干预处理各组大鼠后,检测大鼠甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;HE染色检测大鼠主动脉组织病理变化;油红O染色检测各组大鼠主动脉和肝脏脂质沉积;酶标仪测定大鼠血清炎症因子IL-8、IL-1β、IL-18水平;免疫印迹法检测大鼠主动脉组织AMPK/PGC1α通路蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠主动脉组织发生严重病理损伤,主动脉和肝脏组织中有大量脂质沉积,肝脏脂肪变性严重,血清LDL-C、TC、TG、IL-8、IL-1β、IL-18水平显著升高(P<0.05),血清HDL-C水平、主动脉组织p-AMPK/AMPK与PGC1α蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,降脂逐瘀汤各剂量组大鼠主动脉组织病理损伤、主动脉脂质沉积和肝脏脂肪变性症状均减轻,血清LDL-C、TC、TG、IL-8、IL-1β、IL-18水平均降低(P<0.05),血清HDL-C水平、主动脉组织p-AMPK/AMPK与PGC1α蛋白表达均升高(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05);与降脂逐瘀汤高剂量组相比,降脂逐瘀汤高剂量+盐酸多索啡组大鼠主动脉组织病理损伤、主动脉脂质沉积和肝脏脂肪变性症状加重,血清LDL-C、TC、TG、IL-8、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05),血清HDL-C水平、主动脉组织p-AMPK/AMPK与PGC1α蛋白表达降低(P<0.05)。结论:降脂逐瘀汤可通过激活AMPK/PGC1α信号抵抗炎症发生发展,减轻大鼠主动脉组织病理损伤、主动脉脂质沉积和肝脏脂肪变性症状,改善AS大鼠脂代谢。

虎杖苷通过AMPK/Nrf2途径调控糖尿病大鼠伤口愈合和血管生成的机制研究

目的:基于AMPK/Nrf2途径探讨虎杖苷(PD)对糖尿病(DM)大鼠伤口愈合和血管生成的作用机制。方法:建立DM大鼠模型,将45只DM大鼠随机分为DM组、DM+PD组和DM+PD+ML385组(n=15),另取15只健康大鼠作为对照组,建立伤口愈合受损的模型,DM+PD组大鼠予PD灌胃(20mg/kg),DM+PD+ML385组大鼠在PD的基础上腹腔注射ML385抑制AMPK/Nrf2通路(30mg/kg)。比较各组大鼠伤口愈合情况,通过免疫组化染色检测分析微血管密度,Westernblot及RT-qPCR分析转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)以及AMPK/Nrf2通路转录和翻译水平。结果:四组小鼠的上述指标比较差异显著(P<0.05)。DM组的伤口愈合百分比、生成血管数目、TGF-β1和VEGF蛋白水平、AMPK和Nrf2 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。DM+PD组的伤口愈合百分比、生成血管数目、TGF-β1和VEGF蛋白水平、AMPK和Nrf2mRNA和蛋白表达水平显著高于DM组(P<0.05)。DM+PD+ML385组的伤口愈合百分比、生成血管数目、TGF-β1和VEGF蛋白水平、AMPK和Nrf2 mRNA和蛋白表达水平显著低于DM+PD组而显著高于DM组(P<0.05)。结论:PD可能通过调控AMPK/Nrf2通路诱导血管生成,进而促进DM模型大鼠的伤口愈合。

基于AMPK/mTOR信号通路探讨调中化湿汤对GERD大鼠食管ICC自噬的影响

目的基于AMPK/mTOR信号通路探讨调中化湿汤对GERD大鼠食管ICC自噬的影响。方法将SD大鼠分为假手术组、模型组、西药组、调中化湿汤高、中、低剂量组,每组8只。各组分别予以药物干预持续2周,记录各组大鼠各种情况。结果行为学:调中化湿汤组改善大鼠一般情况更显著;食管粘膜病理:西药组与调中化湿汤组能改善大鼠食管组织炎症损伤,调中化湿汤组效果更明显;透射电镜:调中化湿汤细胞器丰富,自噬小体减少,细胞及线粒体结构修复效果明显,尤其中、高剂量组效果显著;WB:与模型组相比,西药组、调中化湿汤组AMPK、mTOR蛋白表达水平均上升,调中化湿汤组上升更明显;对于LC3II/LC3I,调中化湿汤组稍有下降或未见明显改变,西药组明显上升。PCR:与模型组比较,西药组及调中化湿汤高、中、低剂量组差异无统计学意义;西药组与调中化湿汤低、中、高剂量组比较无统计学差异。结论调中化湿汤可以有效使GERD大鼠拮抗食管ICC自噬,修复食管黏膜组织损伤,其机制可能通过激活AMPK/mTOR信号通路有关。

补肾中药通过AMPK-mTOR通路提高肾精亏虚大鼠睾丸间质细胞自噬能力

为了探究补肾中药提高肾精亏虚大鼠睾丸间质细胞自噬能力的机制,采用单因素电刺激法建立肾精亏虚大鼠模型,免疫组化及Western blot检测各组睾丸细胞自噬标志蛋白Beclin1、p62、LC3B表达水平以及AMPK和mTOR表达变化.基于肾精亏虚与衰老的密切联系,通过自由基氧化损伤法建立睾丸间质细胞(Leydig细胞)衰老模型,联合AMPK抑制剂,探究何首乌饮激活细胞自噬的分子机制.结果显示:何首乌饮可上调睾丸组织Beclin1蛋白、LC3B表达,下调p62蛋白表达,促进AMPK磷酸化并抑制mTOR激活(P<0.05);细胞实验表明,何首乌饮可通过激活AMPK-mTOR信号通路提高Leydig细胞自噬能力(P<0.05),促进肾精亏虚大鼠睾丸Leydig细胞自噬进程.

四君子汤调控AMPK-SIRT1蛋白改善运动性疲劳小鼠学习记忆的机制研究

目的:观察四君子汤对运动性疲劳(EF)小鼠AMPK/SIRT1信号通路的影响,并探讨其改善EF认知损伤和学习记忆能力的机制。方法:将60只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、四君子汤高剂量组、四君子汤中剂量组、四君子汤低剂量组。除空白组外,其他各组小鼠构建脾气虚证EF小鼠模型。四君子汤高、中、低剂量组小鼠分别给予不同浓度的四君子汤灌胃,空白组和模型组以等体积蒸馏水灌胃,各组连续灌胃4周。采用Morris水迷宫实验评估小鼠的认知功能,采用ELISA法检测小鼠血清中乳酸、血糖、肝糖原、肌糖原的水平,Western Blot法检测小鼠脑组织中AMPK和SIRT1的蛋白表达量。结果:实验后,模型组小鼠体质量、摄食量、血糖、肝糖原含量、肌糖原含量、目标象限游泳时间、穿越平台次数、AMPK蛋白表达量、SIRT1蛋白表达量低于空白组,血清乳酸水平高于空白组(P<0.05)。给药干预后,四君子汤高、中、低剂量组小鼠体质量、摄食量、力竭游泳时间、肝糖原含量、肌糖原含量、目标象限游泳时间、穿越平台次数高于模型组,血清乳酸水平低于模型组(P<0.05)。四君子汤高剂量小鼠游泳力竭时间高于低剂量组,乳酸水平低于低剂量组(P<0.05)。四君子汤高、中剂量组肝糖原、肌糖原含量高于低剂量组(P<0.05)。与模型组比较,四君子汤高、中剂量组AMPK及SIRT1蛋白表达量增多(P<0.05),四君子汤低剂量组SIRT1蛋白表达量增多(P<0.05)。与四君子汤低剂量组比较,四君子汤高、中剂量组AMPK及SIRT1蛋白表达量增多(P<0.05)。结论:四君子汤可在一定程度调控AMPK/SIRT1的活性,进而改善EF小鼠脾虚症状。

白果内酯调控AMPK-SIRT3正反馈环路介导的线粒体生物发生改善ATDC5软骨细胞炎性损伤

旨在以AMPK-SIRT3正反馈环路为切入点,探讨白果内酯改善白介素1β(IL-1β)诱导的ATDC5软骨细胞炎性损伤的作用机制。采用IL-1β(10 ng·mL^(-1))诱导ATDC5软骨细胞炎性损伤来构建体外骨关节炎模型,随机分为对照组,IL-1β组,IL-1β和白果内酯共同处理组,其中,共同处理组按照白果内酯的应用浓度又分为低、中和高(15、30和60μmol·L^(-1))3个不同剂量组。免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测各组软骨细胞中ADAMTS4、PGC-1a、Collagen Type II、MMP-3、NRF-1和Fis1的蛋白与mRNA表达情况。试剂盒检测各组ATP含量,并通过免疫荧光方法检测SIRT3表达水平。Western blot检测AMPK-SIRT3正反馈环路相关蛋白p-AMPK、AMPK和SIRT3表达水平。使用Compound C和3-TYP处理ATDC5软骨细胞,构建AMPK-SIRT3信号通路阻断模型,检测下游PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白变化。结果显示,白果内酯通过下调ADAMTS4和MMP-3表达(P<0.05),促进Type II collagen表达(P<0.05)来调节ECM代谢平衡,并促进ATP合成。在机制上,白果内酯干预软骨细胞后p-AMPK、SITR3、PGC-1a和NRF-1水平显著升高(P<0.05),而Fis1蛋白水平显著降低(P<0.05),并且使用Compound C和3-TYP预处理软骨细胞后,PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白水平被不同程度抑制。综上所述,白果内酯通过AMPK-SIRT3正反馈环路激活PGC-1a,调节线粒体生物发生改善ATDC5软骨细胞炎性损伤。

基于AMPK/mTOR通路探讨注射用益气复脉对TBHP诱导H9c2细胞损伤的保护作用

目的:探讨注射用益气复脉(YQFM)通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬减轻叔丁基过氧化氢(TBHP)所致H9c2心肌细胞损伤的机制。方法:体外培养H9c2心肌细胞,分为正常对照组、TBHP组、TBHP+YQFM组。CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞存活率;免疫荧光检测细胞自噬情况;免疫印迹法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达。结果:用2、4、8、16 g/L的YQFM预处理后,可显著恢复TBHP诱导的H9c2细胞损伤;免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,TBHP组细胞LC3荧光强度显著升高(P<0.01);与TBHP组相比,TBHP+YQFM组LC3荧光强度降低,其中2 g/L YQFM组具有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果显示:TBHP组p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著增加,p-mTOR/mTOR比率显著降低;YQFM预处理使自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率明显降低,4 g/L YQFM组p-mTOR/mTOR比率明显升高。结论:注射用益气复脉能有效拮抗TBHP引起的H9c2细胞损伤,其机制与通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬途径有关。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

心肌纤维化与AMPK-mTOR-ULK1信号通路研究进展

心肌纤维化是诸多心血管疾患发生发展的重要病理变化,也是造成心脏泵衰竭及不良心血管事件的病理基础,其主要表现为细胞外基质(ECM)的过度沉积与成纤维细胞(CFs)的不断增殖。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路是介导磷酸化的主要系统,AMPK激活自噬,可抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR),也可磷酸化Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1);AMPK信号通路在心肌纤维化的发生发展过程中起到了重要作用,本文通过分析AMPK-mTOR-ULK1信号通路在心肌纤维化中的作用,以期为心肌纤维化的治疗提供指导。

基于AMPK调控ACC/CPT1信号通路介导脂肪酸代谢探究化瘀祛痰方含药血清对HepG2细胞脂质沉积的影响

目的 观察化瘀祛痰方含药血清对HepG2细胞脂质沉积的影响,并探究其作用机制。方法 采用1 mmol/L油酸棕榈酸混合液诱导HepG2细胞24 h构建脂质沉积模型,分别给予化瘀祛痰方含药血清、AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK]抑制剂及抑制剂+中药联合干预,油红O染色观察脂质沉积情况,试剂盒检测细胞中甘油三酯(triglyceride, TG)含量,蛋白印迹法检测AMPK、p-AMPK、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase, ACC)、p-ACC、肉碱棕榈酰基转移酶-1(Carnitine Palmitoyltransferase-1,CPT1)蛋白相对表达量,以及实时荧光定量法检测细胞中AMPK、ACC、CPT1 mRNA相对表达水平。结果 与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组细胞中脂滴数目减少、TG水平降低,细胞中p-AMPK、CPT1蛋白及CPT1 mRNA相对表达量升高,ACC、p-ACC蛋白及ACC mRNA相对表达量显著降低(P<0.01),AMPK蛋白及基因相对表达水平无明显差别(P>0.05);AMPK抑制剂组细胞中脂滴及TG含量升高,AMPK、CPT1蛋白及mRNA相对表达量降低,ACC、p-ACC蛋白及ACC mRNA相对表达量升高(P<0.05或P<0.01);与AMPK抑制剂相比,抑制剂+中药含药血清组细胞中脂滴数目减少、TG水平降低,AMPK、p-AMPK蛋白及AMPK mRNA相对表达水平无显著差异(P>0.05),ACC、p-ACC蛋白及ACC mRNA相对表达量降低、CPT1则相对表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论 化瘀祛痰方含药血清可能通过激活AMPK使其磷酸化,并调控ACC/CPT1信号通路,抑制脂肪酸合成,促进脂肪酸氧化,从而降低HepG2细胞内的甘油三酯水平及脂质沉积。