烤烟品种大白筋599特征香气性状的物质及分子基础研究

为探索大白筋599特征香气性状的关键致香物质基础和分子机制,为特香型烤烟品种培育及工业利用奠定基础,通过不同品种(系)的表面分泌物检测及烟叶感官鉴定比较,明确大白筋599特征香气性状关键致香物质基础;通过对不同品种中调控关键致香物质合成的基因进行测序,明确大白筋599特征香气性状形成的分子基础。结果表明,烤烟品种大白筋599和香料烟品种Samsun表面分泌物中含有赖百当二萜冷杉醇,而普通烤烟G28等均不含冷杉醇。普通烤烟G28与大白筋599杂交或回交的后代品系中,含有冷杉醇的均具有大白筋599特异香气特性,不含冷杉醇的没有特异香气特性。调控冷杉醇合成的关键基因Nt CPS2的第292位碱基在不同品种间具有多态性,在大白筋599中是野生型碱基G,而在供试普通烤烟及生产主栽品种中是突变型碱基T。冷杉醇是烤烟品种大白筋599特异香气性状形成的关键致香物质。调控冷杉醇合成的关键基因Nt CPS2的第292位碱基在大白筋599及供试普通烤烟品种和主栽品种间的SNP多态性,是导致其香气特征差异的主要原因。通过遗传改良,丰富烟草表面分泌物中致香成分的种类和含量,是培育特色香气风格烤烟品种的重要途径。

顺-冷杉醇诱导烟草抗青枯病的效果及作用机制研究

为探究顺-冷杉醇诱导烟草抗青枯病的适宜处理条件和作用机制,采用盆栽接种方法,研究了顺-冷杉醇灌根施用的适宜浓度、时间间隔和次数,测定了顺-冷杉醇处理后烟草根部主要防御酶活性、植保素和植物激素含量的变化,利用高通量测序技术测定了顺-冷杉醇对烟草根系转录水平的影响。结果表明,顺-冷杉醇施用浓度60~80 mg/L对烟草青枯病的防效为54.50%~57.10%,与阳性对照中生菌素相当,其适宜施用时间间隔为3~6 d,连续施用2~3次;顺-冷杉醇处理后1~6 d烟草根部过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著提高,1~10 d过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著提高,处理后3~6 d多酚类物质和木质素含量显著增加,1~3 d茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)含量显著增加,引起烟草根部抗性基因NtSIPK、NtMEK2、NtMAPK、NtPAL和NtC4H上调表达,提高烟株对青枯病的抗性。由此可知,顺-冷杉醇可作为诱抗剂有效防控烟草青枯病的发生。

烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP功能标记开发与应用

冷杉醇是一些香料烟和部分雪茄烟中主要的赖百当类物质,对烟草的香气风格起着重要作用,然而烤烟中基本不含有。开发分子标记是将这种香气特征转入烤烟的有效途径。本研究基于等位基因特异性PCR (AS-PCR)技术,设计了一系列引物,并最终筛选到引物对1F/R1与其互补引物对8F/R1具有良好的多态性,这两对引物在6个亲本和F1群体也得到了验证。利用两个引物对47份烤烟品种和98份‘中烟100’的高香气突变体进行基因分型,同时利用GC-MS检测表型,最终获得材料‘大白筋599’、‘革新三号’、‘NC2326’和‘TBT6’突变株含有冷杉醇。结果表明,这两对标记可用于烟草育种分子标记辅助选择,含冷杉醇的烤烟种质资源可作为烟草育种的重要亲本材料。

超高效液相色谱法测定烟草中顺-冷杉醇

为准确测定烟草样品顺-冷杉醇的含量(质量分数),通过优化提取方法及液相色谱条件,建立了烟草粉末样品中顺-冷杉醇提取及应用超高效液相色谱-紫外(UPLC-UV)检测的方法,并采用该方法对特香型烤烟品种大白筋599烘烤前后的15份烟叶样品进行了测定。结果表明:①顺-冷杉醇含量在1.60~80.00μg/mL范围内,工作曲线线性良好(r^2=0.9999);②加标回收率为97.63%~109.80%,相对标准偏差(RSD)为2.05%~3.69%,方法检出限为4.00μg/g,定量限为13.30μg/g,RSD为3.43%。③烟草中的顺-冷杉醇在调制过程中大部分降解,降解率为27.92%~89.23%,平均为63.66%。该方法样品前处理简单,分离度好,精密度和准确性较高,适用于烟草中顺-冷杉醇的批量检测。

基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析

为明确柯巴基焦磷酸合酶基因(CPS2)的功能和调控机制,利用CRISPR/Cas9技术对高香气烤烟品系8306中的CPS2基因进行定向编辑,得到了7株靶位点单碱基A/T/C插入的转化植株。利用q-PCR技术分析转化植株二萜类关键基因的表达,并利用GC/MS分析叶面分泌物成分及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)含量(质量分数)。结果表明:①T0代转化植株CPS2及ABS表达量显著降低,冷杉醇和赖百当烯二醇含量也显著降低。②DXR表达量均显著升高,GGPP含量也大幅提高。③CYC-1和CYP71D16表达量差异较大,西柏三烯二醇出现小幅降低。④T0代转化植株的株高、茎围、叶间距、最大叶长、最大叶宽均增加。因此,敲除CPS2能够抑制赖百当类化合物合成,有助于上游途径中萜类合成前体GGPP的积累,可能抑制西柏三烯二醇积累,同时使植株表型性状发生变化。

NtCPS2基因对顺-冷杉醇与赤霉素合成代谢途径的影响

为探讨顺-冷杉醇合成基因NtCPS2对萜类代谢途径的影响,利用基因编辑技术CRISPR/Cas 9编辑烟草顺-冷杉醇合成基因NtCPS2,并筛选出纯合突变植株,命名为‘8306’编辑系;比较‘8306’编辑系(T_(2)-26、T_(2)-45、T_(2)-48)与野生型(WT)在顺-冷杉醇、赤霉素含量及合成关键基因的生物信息学方面的差异。结果表明:‘8306’编辑系(T_(2)-26、T_(2)-45、T_(2)-48)顺-冷杉醇含量平均减少86.20%,赤霉素含量平均增加27.05%;顺-冷杉醇合成途径中的关键基因表达量显著减小,赤霉素合成途径中正调控关键基因GA20ox表达量显著增加,负调控关键基因GA2ox表达量显著减小,并且GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)合成的关键基因DXR表达量增加。NtCPS2基因不仅影响赖百当类二萜代谢途径,有效降低顺-冷杉醇的含量,并且影响赤霉素萜类代谢,增加赤霉素的含量。