基于植物代谢组学和网络药理学分析预测鸡骨草药材的质量标志物

目的基于植物代谢组学分析鸡骨草药材的次生代谢产物,并结合多元统计学和网络药理学预测分析鸡骨草药材的质量标志物(Q-Marker)。方法建立UPLC-Q-TOF-MS分析方法,分析11批次鸡骨草药材的化学成分,确定其共有成分。通过聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)确认造成11批次鸡骨草药材分类的主要差异成分,再运用网络药理学构建“核心成分-核心靶点-核心通路”网络,筛选预测鸡骨草药材的潜在Q-Marker,并进行分子对接验证其活性。结果11批次鸡骨草药材中含有39个共有成分,主要为三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类等。经聚类分析和主成分分析显示11批次鸡骨草药材分为4类,后经偏最小二乘判别分析发现其中9个化学成分在分类中起重要作用。网络药理学分析结果表明,以上9个成分为活性成分,作用于166个靶点,通过蛋白质互作(PPI)筛选得到29个核心靶点,其中4个化学成分相思子碱、下箴刺桐碱、大豆皂苷Ⅰ、精氨酸与核心靶点的关联度高,结合QMarker理念及分子对接结果,初步预测相思子碱和下箴刺桐碱为鸡骨草药材的Q-Marker。结论利用植物代谢组学结合多元统计学和网络药理学预测分析鸡骨草药材的Q-Marker,为鸡骨草药材的质量控制与评价提供数据参考,为进一步科学开发鸡骨草药材提供研究思路。

全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的:构建及表达全人源抗肝癌MAGE鄄A1单链抗体(A3)与相思子毒素A链(Abrin鄄A)的原核表达载体,并检测其对人BEL7402肝癌细胞系的杀伤作用。方法:应用PCR方法体外扩增A3基因,经测序后重组入原核表达载体pBAD/gⅢ鄄Abrin鄄A相应位点上,将构建正确的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A表达质粒转化E.coliTOP10,左旋阿拉伯糖诱导表达。表达产物经蛋白纯化及活性鉴定,采用MTT法检测其对BEL7402细胞的体外杀伤作用。结果:构建的重组免疫毒素表达载体pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约60kD;纯化的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A对BEL7402细胞的最大杀伤率为70.17%,IC50为3.12μg/ml。结论:构建、表达的全人源抗肝癌A3/Abrin鄄A融合免疫毒素对肝癌细胞有较明显的杀伤作用。

相思子毒素-a的纯化及鉴定

采用硫酸铵分级分离法和凝胶层析法,从相思子种仁中分离纯化出一种毒蛋白P1′。凝胶薄层扫描测得纯度≥97%;SDS-PAGE电泳测定其相对分子质量为64300;经β-巯基乙醇处理,P1′分离为A、B 2条链,相对分子质量分别为29100和35400;经腹腔注射,小鼠LD50为2.11μg/kg;P1′质量浓度≥3.91 mg/L时,可凝集兔红细胞;P1′的B链N末端8个氨基酸序列为:I-V-E-K-S-I/L-I-N,与相思子毒素-a(abrin-a)和相思子毒素-b(abrin-b)同源性较高,为75%;肽质量指纹谱(PMF)分析表明,P1′与abrin-a匹配强度最高,为86%,与abrin-b、相思子毒素-c(abrin-c)和相思子毒素-d(abrin-d)匹配强度均为10%,表明毒蛋白P1′为abrin-a。abrin-a经1%甲醛减毒处理制备类毒素,家兔5次免疫后获得了效价高、特异性较强的抗血清。

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

HPLC法测定鸡骨草药材中相思子碱的含量

目的:建立测定鸡骨草药材中相思子碱含量的高效液相色谱法。方法:Kromasil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16),流速1.0 mL·min^(-1),检测波长280 nm。结果:对不同来源的17批鸡骨草药材进行了测定,其相思子碱的含量在0.02%～0.66%之间。相思子碱在0.1～4.0μg范围内线性关系良好(r=0.9999,n=8),平均回收率为99.2%(n=9)。结论:该方法可以用于鸡骨草药材的质量控制。

相思子毒素的分子特点及其在临床中的应用前景

相思子毒素是从豆科植物 (AbrusPrecatoriusL .)种子中分离的一种细胞毒性蛋白。它由A ,B两条链组成 ,由一个二硫键相连 ,B链具有半乳糖凝集活性 ,可与细胞膜上受体结合 ,帮助A链进入细胞内 ,A链进入细胞催化 6 0S大亚基的 2 8SrRNA的第 4 32 4位脱去腺嘌呤而使 6 0S核糖体亚基失活 ,从而使细胞蛋白合成被抑制。本文综述了有关相思子毒素的分子结构特点。

天然药物中的毒蛋白,多肽及氨基酸的研究概况

简要介绍几种天然药物中存在的毒蛋白 ,多肽和氨基酸类化合物。对收集到的有关文献资料分析蓖麻毒素、相思子毒素、寄生毒素、蛇毒、蜂毒、蝎毒等毒素的分布 ,化学结构、性质及药理毒性。这类化合物对动物、完整细胞或细胞溶解物具有一定的毒性和生物活性 ,值得进行深入开发利用。

一种基于金磁微粒的电化学发光免疫检测方法

基于金磁微粒(GoldMag particles)的磁性分离富集性能与良好的生物相容性,直接在金磁微粒表面吸附固定相思子毒素多抗制备捕获探针,以三联吡啶钌标记相思子毒素单抗作为电化学发光探针,两者与相思子毒素发生特异性免疫反应形成夹心复合物,成功建立了一种简单、快速、灵敏的相思子毒素电化学发光免疫检测方法。利用此方法检测相思子毒素,其浓度在0.2～1 500μg/L范围内与电化学发光强度成良好的对数线性关系,检出限为0.2μg/L。与生物素-亲和素固定法相比,该法的检出限相当,其线性范围更宽、操作更简化,具有通用性,可以此为基础发展生物毒素及其它蛋白的检测方法,用于临床诊断、环境监测及生物防护等领域。

相思子毒素研究进展

相思子毒素类似于蓖麻毒素,是一种植物蛋白毒素,具有极强的细胞毒性作用,特别是对某些恶性肿瘤细胞的毒性更强,这使它成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。文章就其毒性、结构、毒理、基因克隆以及应用方面做了简要的综述。

相思子毒素-a双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

以已制备的抗相思子毒素-a(abrin-a)的单克隆抗体(McAb)4G1和兔源多抗建立了abrin-a双抗体夹心ELISA法。abrin-a质量浓度在15.62~250.00μg/L的范围内,质量浓度的对数值与其D450值呈直线相关,回归方程为y=1.0467x+0.5277(R2=0.9992,n=5),检测灵敏度为7.81ng/mL。该法与相思子凝集素、蓖麻毒素(ri-cin)和蓖麻凝集素无交叉反应。经初步用于人工污染abrin-a香肠样品和自来水样品检测,回收率分别为92.0%和85.0%,变异系数(CV)<6%。表明该检测方法具有快速、特异、灵敏等特点,可望用于食品、饲料和饮用水中abrin-a检验。

一种压阻式微悬臂梁免疫传感器及其动力学分析

针对传统光学读出微悬臂梁传感器所需测量系统复杂的局限,将生物素—亲和素系统的放大效应与压阻式微悬臂梁传感技术结合起来,成功构建了一种读出方式简单的压阻式微悬臂梁免疫传感器。利用构建的传感器对相思子毒素进行检测,检测限达8μg/L,反应在20 min内基本完成,具有很好的特异性和重现性,能满足水样、土壤、食品等实际模拟样品检测的要求。建立了压阻式微悬臂梁免疫传感器检测相思子毒素的反应动力学模型,并对实际检测数据进行了拟合分析,相关系数R值在0.971 1以上(P<0.001)。根据拟合方程求出的传感器对不同浓度相思子毒素反应达到平衡的响应电压ΔU e、响应时间t0均与实测值非常接近。

基于生物素-亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究

利用生物素-亲和素系统的放大作用和纳米金质量扩增效应,建立了压电免疫传感器检测相思子毒素的新方法。首先在石英晶体的金电极上依次组装二巯基丙酸、EDC和NHS进行表面修饰,然后通过亲和素固定生物素标记相思子毒素多抗来制备敏感膜,利用纳米金的质量扩增效应设计了一种"毒素-纳米金标记单抗"复合物,成功实现了对相思子毒素的检测,提高了传感器灵敏度和重现性。本传感器对相思子毒素响应的线性范围为0.05～5mg/L;回归方程为Δf=50.81CAbrin+67.11(r=0.9903,n=10,P<0.0001);检测灵敏度为50.81Hz.L/mg。

相思子毒素抑制肿瘤活性研究进展

采用手工检索和联机检索相结合,查阅了近年来国外有关相思子毒素抗肿瘤的文献资料,对相思子毒素的抗肿瘤活性研究进行了综述,认为相思子毒素对大多数肿瘤有抑制作用,应进一步深入研究,很可能为癌症的治疗开辟新的途径。

高效液相色谱法测定鸡骨草胶囊中相思子碱的含量

目的建立鸡骨草胶囊中相思子碱的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法测定鸡骨草胶囊中相思子碱的含量。色谱柱为Phenomenex-ODS（250 mm×4.0 mm,5μm）柱;流动相为甲醇-0.5%（体积分数）冰乙酸溶液,梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;检测波长为270 nm;温度为室温。结果相思子碱质进样量在0.510μg范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 8）,平均加样回收率为101.89%（n=6）。结论该方法操作简便、快速,有良好的精密度和准确性,可为鸡骨草胶囊质量控制提供参考。

三种方法纯化相思子毒素单抗的比较

采用不同的方法纯化相思子毒素单抗,寻求一种效果好、操作简便的纯化方法。采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-蛋白A亲和层析法三种方法分离纯化相思子毒素单抗,并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)对纯化产物进行相对分子质量、浓度、纯度、回收率及免疫活性的鉴定。结果表明,纯化后单抗的回收率以硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵-蛋白A亲和层析法较低;产物纯度以硫酸铵-蛋白A亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵沉淀法较差;不同方法纯化后的单抗活性未见降低。

鸡骨草中生物碱的提取与测定

目的优化鸡骨草中生物碱的提取工艺,建立相思子碱、下箴刺桐碱的超高效液相色谱（UHPLC）测定方法。方法 以相思子碱、下箴刺桐碱的提取量为指标,采用正交试验设计考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对提取工艺的影响;色谱条件：Shim-pack XR-ODSⅡ色谱柱（2.0 mm×75 mm,2.2μm）;流动相：甲醇-乙腈-水-乙酸-三乙胺（6∶2∶92∶0.2∶0.3）;检测波长280 nm;流速0.4 mL/min;进样量2μL;柱温30℃。结果 最佳提取条件为加10倍量45%乙醇,提取时间40 min,超声提取2次;相思子碱和下箴刺桐碱分别在1.49-148.80μg/mL（r=0.9998）,0.84-84.20μg/mL（r=0.9998）范围内有良好的线性关系,加样回收率为98.9%、98.2%,RSD均〈2%。结论 本提取方法简单、快速、效率高;测定方法准确、高效;不同产地鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱含量差异明显,以根部含量最多,其次为茎部,最少的部位是叶子。为鸡骨草药材的有效开发利用和质量控制提供了参考依据。

加标香肠及水样品中相思子毒素-a高效液相色谱检测

应用高效液相色谱法（HPLC）定性和定量检测加标香肠和水样品中相思子毒素-a（abrin-a）。在固定相为Shodex Protein KW-802．5色谱柱，流动相为0．5mol／L的磷酸盐缓冲液（PB，pH7．3），流速为1mL／min，柱温为25℃，检测波长为280llin等条件下，测定结果：abrin-a保留时间（9．80±O．02）min（n=25）；浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性范围11．765—941．200μg/ml；最低检测限44ng；加标香肠和水样品中abrin-a回收率分别为104．6％和97．9％。测定结果表明，该方法简便、快速、灵敏度较高、重现性好。

基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究

以多克隆抗体包被磁性微球制备捕获探针,以表面负载大量三联吡啶钌标记物的噬菌体展示抗体为发光探针有效放大信号,成功建立了相思子毒素电化学发光免疫传感检测方法。利用本方法检测相思子毒素,浓度在0.005～100μg/L范围内与电化学发光强度呈良好的对数线性关系,拟合方程为lgY=0.701lgX+1.767(R=0.9964,N=7,p<0.0001),检测限达0.005μg/L(S/N=3)。与采用单克隆抗体制备标记探针相比,检测灵敏度提高20倍,可用于相思子毒素的痕量检测。

相思子毒素-a单克隆抗体的制备与鉴定

用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠。采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。将阳性细胞株接种BALB/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点。结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的McAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的McAb;制备的McAb可用于abrin-a含量的检测。

微波辅助提取-高效液相色谱分析制备鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的研究

建立了鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的微波辅助提取-高效液相色谱(MAE-HPLC)分析方法。优化得到的最佳微波辅助提取条件为:以25%甲醇为溶剂、固液比1:10(m/V)、提取温度50℃、提取时间10min。分析了广东、广西等7个不同产地鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱含量,其中相思子碱含量范围0.03～0.84mg/g,回收率89.6%～92.9%,相对标准偏差(RSD)0.4%～3.9%;下箴刺桐碱含量范围0.06～0.62mg/g,回收率88.8%～95.5%,RSD 1.1%～3.4%。利用半制备高效液相色谱分离得到了相思子碱和下箴刺桐碱对照品,并采用电喷雾质谱(ESI-MS)和核磁共振(1H NMR)对其结构进行了表征。