Accutase和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的探讨Accutase和胰蛋白酶消化神经干细胞（NSCs）后对其凋亡过程的影响。方法来自人类12～16周自然流产胚胎纹状体组织,分离并体外培养NSCs,将体外培养的第3～5代神经球,分别用胰蛋白酶、Accutase消化,消化过程中仅振荡打散,避免巴斯德吸管反复吹打。将神经球打散成的单细胞悬液接种。用Annexin V/碘化丙啶染色、Hoechst 33342活细胞染色镜下观察等方法,在培养传代后2和24 h时间点检测神经干细胞凋亡率。结果两种酶消化后立即用台盼蓝染色判断细胞活性,Accutase消化后活细胞比例为（91.65±4.43）%,胰蛋白酶仅有（83.10±6.76）%,二者比较差异有统计学意义（P〈0.05）。体外培养的第3～5代人胚纹状体NSCs形成的神经球传代后2 h,Accutase和胰蛋白酶传代的细胞凋亡率差异有统计学意义（P〈0.01）,而到24 h时间点,Accutase消化的细胞凋亡率经Annexin V/碘化丙啶、Hoechst 33342活细胞染色两种方法检测已经达到50%,而胰蛋白酶消化后的细胞凋亡率在此时间点维持在15%～20%。Accutase消化后的NSCs生长4 d后,克隆形成率和神经球直径分别为（7.83±1.32）%和（43.5±9.76）μm,均显著低于胰蛋白酶传代组的（19.22±3.66）%和（58.4±18.73）μm（P〈0.01）。结论虽然台盼蓝染色显示Accutase消化神经球后的细胞存活比胰蛋白酶更多,但消化后24 h内,Accutase消化的细胞凋亡率显著升高,最终神经球新克隆形成率低,直径更小。胰蛋白酶消化振荡打散神经球后的凋亡率较Accutase具有明显优势;神经球消化后台盼蓝即时染色的结果不足以预示后期NSCs凋亡率。

Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

背景:有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性,对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性,在消化结束时无需终止和清洗,有保护细胞表面抗原的特殊作用,因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。目的:比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。方法:新生5-7 d昆明雄鼠45只,取双侧睾丸胶原酶初步消化,混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组),不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1,3,5 min后显微镜下观察并拍照,比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间;获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率;通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞,经包被有干细胞标志分子CD90.2的免疫磁珠进行分选,将所得CD90+及CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记,流式细胞仪检测不同组别CD90+及CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。结果与结论:不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异,其中Accutase酶能更快获取单细胞悬液,其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组,其所得细胞总数高于其余2组,而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高,流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%,高于胰酶组及混合酶组(51.16%,71.27%);而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%,24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。

Accutase消化传代对人胚胎纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的:观察人类胚胎纹状体来源神经干细胞(neural stem cells,NSCs)经消化酶accutase消化传代后是否发生了大量细胞凋亡。方法:提取人13~18周自然流产胚胎脑组织纹状体的NSCs,体外形成神经球并培养至3~5代。经消化酶accutase消化后传代,运用活性caspase-3染色、TUNEL(Td T-mediated d UTP nick end labeling)染色等方法对多聚甲醛固定的NSCs进行凋亡检测,同时采用Annexin V和Hoechst33342/PI等联合染色方法对活细胞进行凋亡鉴定,以确定NSCs在体外传代后的凋亡情况。结果:在传代后检测的3个时间点(1,24,72 h)中TUNEL染色和活性caspase-3染色均高度重合。传代后1 h,TUNEL和活性caspase-3染色所检测到的凋亡率为20%~25%,传代后24 h增高为75%~80%(P<0.01),而传代后72 h,由于存活下来的细胞开始增殖,所以整体凋亡率降为60%~70%,明显低于24 h(P<0.01)。结论:由人类纹状体来源NSCs形成的神经球,经accutase消化传代后24 h内即发生大量细胞凋亡。对于体外培养的NSCs,抑制其凋亡可能是促使其自我更新和增殖,最终起到提高细胞扩增能力的有效手段。

采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞及其电生理学特性分析

目的 采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞,并对其电生理学特性进行分析。方法 将人诱导多能干细胞在体外分化为心肌细胞。选择培养28~32天活性良好的心肌细胞,免疫细胞化学检测心肌细胞肌钙蛋白(cTNT)和肌动蛋白(α-actin)表达,膜片钳全细胞技术记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞的动作电位。记录动作电位前采用Accutase酶将人诱导多能干细胞来源心肌细胞消化成单个心肌细胞,依据消化时间不同随机分为A、B、C、D、E组,各组消化时间依次为0.5、1、2、5及10 min,每组分别记录5~6个来自不同培养皿的细胞自发动作电位。对自发动作电位的频率、静息电位、阈电位、振幅、最大去极化速率、复极时间、超极化电位和最大自动除极速率进行分析。结果 免疫荧光显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞高表达心肌特异性标志物cTnT和α-actin;细胞消化前,肉眼下可见人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发跳动;各组细胞全细胞记录模式建立前的巨阻封接形成时间随着消化时间延长逐渐缩短[(4.80±1.10) min、(2.10±0.55) min、(2.20±0.84) min、(2.30±0.45) min、(0.75±0.27) min,P<0.01]。各组间建立全细胞记录模式的细胞膜电容和串联电阻无差异。消化后膜片钳全细胞模式记录显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发动作电位,并有明显平台期,随着消化时间延长,平台期逐渐缩短[各组90%复极时间依次为:(0.77±0.02) s、(0.78±0.06) s、(0.65±0.03) s、(0.45±0.01) s、(0.35±0.03) s,P<0.01]。结论 采用Accutase酶对人诱导多能干细胞来源心肌细胞进行分离有助于膜片钳记录。相比其他消化时间,Accutase酶消化1 min记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位相对省时,同时可获得最佳动作电位形态。

胎鼠原代脊髓神经元分离培养方法的改良

目的:介绍一种改良原代胎鼠脊髓神经元的分离培养方法.方法:取育龄期雄、雌SD大鼠各36只,合笼配种怀孕.取受孕10~12d、13~15d及16~18d的SD大鼠各6只,解剖分离胚胎脊髓,按常规胰酶消化法制备单细胞悬液,应用细胞计数板及台盼蓝染色,在显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率,明确最佳取材胎龄;接着以上述最佳取材胎龄为取材时间点,每组6只孕鼠,按无酶法、胰酶法和Accutase酶法消化三种不同的方法制备单细胞悬液,显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率.接种、纯化细胞并培养1、3、7d后,用倒置相差显微镜观察脊髓神经元生长状态,利用神经元特异性标志物βtubulinⅢ与细胞核双标记法鉴定培养脊髓神经元的纯度.结果:孕13~15d组细胞总量和存活细胞量高于孕10~12d组,细胞存活率高于孕16~18d组(P<0.05).Accutase酶组获取的细胞总量、存活细胞量以及细胞存活率均明显高于常规无酶组及胰酶组(P<0.05).在倒置相差显微镜下观察发现,脊髓神经元培养7d后,胞体周围逐渐出现光圈,神经突起逐渐伸长,最终形成密集的神经突起网络;与无酶组及胰酶组相比,Accutase酶法分离的脊髓神经元分布更加均匀并且神经突起形成的网更密集.经βtubulinⅢ和hoechst33342荧光染色鉴定,Accutase酶组、无酶组及胰酶组三组分离提取培养的脊髓神经元纯度分别为(90.29±2.55)%、(83.51±6.20)%和(88.10±4.07)%,组间无统计学差异(P>0.05).结论:13~15d胎龄是原代培养脊髓神经元的最佳取材时间;Accutase酶法相较于常规无酶法、胰酶法所获取的脊髓神经元产量更大、生长状态更好,可作为体外研究脊髓神经元病变的细胞模型.