LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-LncRNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和TargetScan软件预测lncRNA13164靶向的miRNA及miRNA靶向的mRNA。通过PCR和RT-qPCR验证lncRNA13164和ace-miR-4968的真实表达及二者间的结合关系。通过饲喂dsRNA对蜜蜂球囊菌侵染的中蜂幼虫肠道内lncRNA13164进行RNAi,进而检测lncRNA13164的沉默效果及ace-miR-4968和3个免疫基因(stk、e3ul和or1)的相对表达量。【结果】相较于未接种组,lncRNA13164的表达量在蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道内上调,在5和6日龄幼虫肠道内显著上调。LncRNA13164可靶向ace-miR-4968等15个miRNA并形成1个调控网络。ace-miR-4968共靶向79个基因,可注释到17个基因本体论(gene ontology,GO)条目和85条京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路。LncRNA13164与ace-miR-4968在中蜂幼虫肠道内均真实表达。相较于未接种组,接种组5日龄幼虫肠道内ace-miR-4968-y极显著下调表达,与lncRNA13164的表达趋势相反。相较于dsRNA-egfp饲喂组,dsRNA-lncRNA13164饲喂组5和6日龄幼虫肠道内lncRNA13164的表达量均极显著下调(P<0.01),沉默效率分别为66.05%和56.45%。沉默lncRNA13164后,ace-miR-4968的表达量在5日龄幼虫肠道内极显著上调,stk、e3ul和or1的表达量均显著下调(P<0.05)。【结论】饲喂dsRNA可有效沉默中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达,lncRNA13164通过ace-miR-4968调控丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase Doa isoform X4)基因stk、E3泛素蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,MYLIP)基因e3ul和抗氧化蛋白1亚型X6(oxidation resistance protein 1 isoform X6)基因or1表达,进而介导宿主对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答。

KemEcal 4968凝聚剂对铀溶液中硅的脱除

铀矿酸法水冶采用浓硫酸浸铀,矿石中的硅酸盐随同浸出后在浸出液中形成硅的累积,对离子交换和溶剂萃取工艺造成不利影响。采用一种新型聚羧酸凝聚剂KemEcal 4968,分别以30、70、140 mg/L的用量,对中广核纳米比亚湖山铀矿浸出澄清液(PLS)和浸出矿浆(LDS)的硅进行脱除试验。结果表明,30~140 mg/L用量KemEcal 4968凝聚剂对PLS溶液除硅率可达42%~62%,而对LDS除硅率只有11%;KemEcal 4968絮凝除硅过程中不会造成体系铀、铁组分的损失;PLS除硅残留KemEcal 4968对逆流倾析浓密机组(CCD)固体沉降速率和上清液浊度影响较小。KemEcal 4968凝聚剂是该矿山较好的除硅备选试剂。综合考虑除硅效果,兼顾避免KemEcal 4968凝聚剂过量残留,以及过多硅被沉淀会造成CCD底流密度增加而影响泵送性能,建议KemEcal 4968凝聚剂用量采用30 mg/L为宜。

过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic,mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor,inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在4日龄幼虫肠道中极显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调。ace-miR-3720与基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1之间存在潜在靶向关系。与mimic-NC组相比,mimic-miR-3720组中CKⅠ表达量在4和5日龄幼虫肠道中皆极显著下调,在6日龄幼虫肠道中显著下调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;βGBP1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;此外,4和5日龄幼虫肠道重量均极显著降低,6日龄幼虫肠道重量显著降低。与inhibitor-NC组相比,inhibitor-miR-3720组中CKⅠ表达量在4-6日龄幼虫肠道中皆极显著上调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著上调,在5和6日龄幼虫肠道中极显著上调;βGBP1表达量在4和6日龄幼虫肠道中显著上调,在5日龄幼虫肠道中极显著上调;此外,4和6日龄幼虫肠道重量显著升高,5日龄幼虫肠道重量极显著升高。【结论】ace-miR-3720在中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物可对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内分别实现miRNA的有效过表达和敲减;ace-miR-3720可能通过调控CKⅠ,MAPK1和βGBP1的表达影响中华蜜蜂工蜂幼虫肠道重量并参与幼虫肠道发育。

过表达和敲降ace-miR-3759-y对中华蜜蜂幼虫靶基因表达及体重的影响

【目的】miRNA在昆虫的生长、发育和代谢等诸多生物学进程中发挥关键调控作用。本研究对ace-miR-3759-y进行表达和序列验证,并通过过表达与敲降ace-miR-3759-y探究其对中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫靶基因表达及重量的影响,以期为ace-miR-3759-y调控幼虫发育的分子机理研究提供依据。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证ace-miR-3759-y的表达和序列。通过饲喂模拟物(Mimic)和抑制物(Inhibitor)对中华蜜蜂幼虫血淋巴中的ace-miR-3759-y进行过表达和敲降。利用RT-qPCR检测ace-miR-3759-y的过表达和敲降效果及靶基因相对表达量。利用电子天平对幼虫进行称重。【结果】ace-miR-3759-y在中华蜜蜂幼虫肠道和血淋巴中真实存在和表达。相较于Mimic-NC组,ace-miR-3759-y在Mimic-ace-miR-3759-y组4日龄和5日龄幼虫血淋巴中显著上调(P<0.05),在6日龄幼虫血淋巴中上调表达但组间差异不显著(P>0.05)。相较于Inhibitor-NC组,Inhibitor-ace-miR-3759-y组4、5和6日龄幼虫血淋巴中均显著下调表达(P<0.05)。过表达ace-miR-3759-y后,CIC在4、5和6日龄幼虫血淋巴中的表达量均显著下调(P<0.05);CKI在4日龄和5日龄幼虫血淋巴中的表达量显著下调(P<0.05),在6日龄幼虫血淋巴中下调表达但组间差异不显著(P>0.05)。敲降ace-miR-3759-y后,CIC在5日龄幼虫血淋巴中显著上调表达(P<0.05),在4日龄和6日龄幼虫血淋巴中上调表达但组间差异不显著(P>0.05);CKI在4日龄幼虫血淋巴中显著上调表达(P<0.05),在5日龄和6日龄幼虫血淋巴中上调表达但组间差异不显著(P>0.05)。此外,与Mimic-NC组相比,Mimic-miR-3759-y组的6日龄幼虫的体重下降,但组间差异不显著(P>0.05);与Inhibitor-NC组相比,Inhibitor-miR-3759-y组的6日龄幼虫体重上升,但组间差异不显著(P>0.05)。【结论】通过饲喂Mimic和Inhibitor的方法在中华蜜蜂幼虫血淋巴中实现了ace-miR-3759-y的有效过表达及敲降,ace-miR-3759-y负调控CIC和CKI的表达,ace-miR-3759-y对幼虫体重无显著影响。