一株耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans FBKL1.0204的筛选鉴定及耐酸、产酸特性

耐酸乳杆菌是浓香型白酒窖池发酵中后期酒醅中的优势菌,此时酒醅酸性较强。采用传统分离纯化法分离酒醅中细菌,经形态学特征和生理生化特性分析,并结合16S rDNA基因序列同源性分析和管家基因pheS和rpoA序列同源性分析及耐酸性筛选,分离鉴定出1株耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)FBKL1.0204。采用比浊法、电极电位法和高效液相色谱法测定菌株在不同酸胁迫下的生物量、pH和有机酸的变化。耐酸特性研究表明,在乳酸、乙酸和盐酸酸化的酸性发酵环境中,FBKL1.0204能耐受pH 4的酸性环境,极端生存pH值为3;产酸特性研究表明,FBKL1.0204为异型乳酸发酵,主要代谢生成乳酸和乙酸,最终使发酵液pH值降至3.5左右,在乙酸调节pH值为6的MRS培养基中,其代谢生成乳酸和乙酸含量最高,分别为(28.32±0.54)g/L和(2.73±0.52)g/L。由此可见,FBKL1.0204具有优良的耐酸和产酸特性,有利于其在白酒酿造过程中生长繁殖并丰富白酒风味。

豉香型白酒醪液源耐酸乳杆菌La50发酵特性研究

该研究以分离自豉香型白酒醪液中的耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)La50为研究对象,对其生长特性、产酸能力及耐受性进行分析,并将其应用于豉香型白酒发酵,对其发酵特性进行研究。结果表明,耐酸乳杆菌La50生长旺盛,对数期(2~38 h)较长,最适生长温度为37℃、最适生长p H为5;可耐受pH值3.0、7%NaCl和42℃的高温环境,具有较好的环境耐受性;其在改良MRS液体培养基中37℃发酵72 h时,总酸含量为18.49 g/L,具有较好的产酸能力;其发酵液中乳酸含量最高[(19.14±0.36)g/L],其次是乙酸[(4.08±0.24)g/L]和苹果酸[(2.87±0.13)g/L],柠檬酸和琥珀酸未检出。通过模拟酿酒发酵试验发现,与对照组相比,试验组模拟发酵酒样中总酸、总酯和乳酸含量分别提高74.47%、189.19%和179.23%;挥发性风味物质总含量提高,其中酯类物质和醇类物质分别提高311%、13.94%,且乙酸乙酯含量提升最明显,提高81.88%。此外,仅在试验组模拟发酵酒样中检测出乙酸己酯、辛二酸二乙酯和醋酸。综上,该菌株有作为发酵菌剂提升豉香型白酒风味和口感的潜在应用价值。

食醋中污染菌的分离与鉴定

首次关于耐酸乳杆菌是引起食醋变质的报道,旨在为食醋生产企业进行微生物污染控制提供理论依据。采用PCRDGGE技术以及纯培养技术,对正常醋样和污染醋样的微生物群落结构和种类进行了研究,通过对比分析以及回接实验发现了引起食醋变质的污染菌为耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)。

一株啤酒污染菌的分离鉴定及快速检测方法

在成品瓶装啤酒中分离得到l株有害的污染菌。经表型性状分析、生理生化反应、G＋C含量测定以及16SrDNA序列分析，鉴定为Lactobacillus acetotolerans。建立了1种新的快速鉴定啤酒有害菌的PCR方法，这种方法基于抗酒花基因horA的部分序列。用传统的检测方法检测有害菌需要8-10d，而用新的PCR方法仅需24～32h。

耐酸乳酸杆菌物种特异性引物设计及其在古井贡酒窖泥酒醅质量评价中的初步应用

古井贡酒的酿造过程中,窖泥和酒醅中发现大量耐酵乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),对该菌快速特异性检测非常重要。该文利用L. acetotolerans菌及大量Lactobacillus类似菌种的全基因组序列与PRIMERBLAST方法,设计了几对L. acetotolerans特异性引物,其中2对经过系列验证具有较好的特异性,可结合QPCR技术对不同质量和不同发酵阶段的窖泥进行L. acetotolerans含量的快速检测。结果表明,古井贡酒窖泥中L. acetotolerans含量总体明显低于酒醅,老窖泥中L. acetotolerans含量总体明显低于新窖池窖泥;而酒醅中老厂区和新厂区L. acetotolerans含量平均来看都很高,但样本之间存在明显波动。所用L. acetotolerans特异性引物可对浓香型白酒发酵样本中L. acetotolerans的相对含量测定并辅助评估窖泥酒醅质量。

啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌种特异性检测体系的建立与应用

以耐乙酸乳杆菌的3个特异性基因为靶标,设计并优化了3对耐乙酸乳杆菌的特异性引物,建立了基于SYBR GREEN实时荧光定量PCR的耐乙酸乳杆菌定性定量检测的标准检测(standard operation procedure,SOP)方法。利用耐乙酸乳杆菌CN247的基因组DNA作为标准品绘制了标准曲线,实现了对耐乙酸乳杆菌的定量检测,耐乙酸乳杆菌的最低检测限可达100 CFU/mL,精度可达10 CFU/mL。大生产样品在培养基中富集培养48 h后即可满足检测的要求,检出率为100%,整个检测时间控制在3 d以内,满足了啤酒企业对出厂产品快速检测的质量控制要求。

一株食醋污染菌CICC10774的鉴定及其生长代谢特性

【目的】对食醋污染菌CICC 10774进行多相分类学鉴定,并对其生长特征和代谢产物进行研究。【方法】通过16S r RNA基因序列系统发育学分析,结合形态特征和生理生化特性确定该菌株的分类学地位。通过分光光度法测定菌株生长的最适温度和最适p H值,确定其最佳培养条件。采用HPLC测定该菌株代谢产物。【结果】多相鉴定分析表明菌株CICC 10774为耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),革兰氏染色呈阳性,兼性厌氧生长,具有明胶酶活性,能够利用葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、海藻糖和龙胆二糖作为碳源底物生长。生长代谢特性研究表明,CICC 10774的最适生长温度为37°C,最适p H值为5.0,代谢产物主要为醋酸和乳酸,是一株典型的耐酸菌。【结论】对引起食醋污染的耐酸乳杆菌CICC 10774生长代谢特征进行了研究,为食醋生产企业生产过程的微生物控制提供理论基础。

VBNC状态啤酒易感乳杆菌的诱导及复苏

本文研究了一种典型的难培养啤酒易感乳杆菌-耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)形成"活的但不可培养"(VBNC)的诱导方式,以及从此状态复苏至可培养状态的方法。将培养至对数期的耐酸乳杆菌2011-11菌株采用啤酒内连续传代驯化法还原其在啤酒酿造过程中的实际生存状况,并通过荧光染料染色对诱导后的耐酸乳杆菌细胞进行活性检测;利用逐步升温和添加促进物法对VBNC菌进行复苏试验。当连续传代至第19代,MRS检测平板上可培养菌数降为零,此时菌体多数仍存在呈现绿色荧光的活细胞,表明耐酸乳杆菌已形成VBNC状态,且仍具有污染啤酒能力;将刚进入VBNC状态的耐酸乳杆菌菌悬液经过氧化氢酶处理后涂布于MRS平板,于26℃厌氧培养,可使耐酸乳杆菌复苏至可培养状态。本研究证实,可通过啤酒内连续传代诱导获得VBNC状态耐酸乳杆菌,而添加过氧化氢酶改良常规MRS平板是一种有效的复苏方法。

啤酒腐败菌的分离鉴定和耐乙酸乳杆菌定量检测方法建立

本研究从啤酒污染样品中分离到24株细菌,经鉴定分属11个菌种。利用耐酒花基因horA、horB和horC的特异引物分析表明,不同菌株的耐酒花基因存在差别。研究中首次在啤酒样品中分离到耐乙酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans )。利用耐酒花基因对耐乙酸乳杆菌的定量检测结果表明,检出限可以达到2.2×10^2CFU/mL。研究结果增加了啤酒腐败菌库中腐败菌的种类,为啤酒生产企业开发针对本企业腐败菌检测提供方法参考。

黄酒贮存酸败关键微生物的分离鉴定

【背景】贮存陈酿是黄酒生产的重要工艺环节,但由于黄酒中营养物质含量丰富,贮存陈酿过程中时常出现酸败变质的现象,尤其是在大罐的陈酿过程中酸败的发生对黄酒行业造成较大的经济损失。【目的】解析黄酒贮存陈酿过程中造成黄酒酸败的关键微生物,为黄酒贮存酸败微生物的控制提供依据。【方法】采用高通量测序技术分析不同来源酸败黄酒中的主要微生物种类;设计针对性培养基分离培养酸败黄酒中的难培养微生物;设计微生物特异性引物,对16S r RNA基因高度相似的酸败微生物进行区分鉴定;将分离的黄酒酸败微生物接入到未发生酸败的黄酒中验证其生酸能力。【结果】高通量测序技术分析结果显示,酸败黄酒中污染微生物主要为乳酸杆菌属(丰度>95%)微生物,在种水平上分析比对结果显示两种难培养微生物[耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)和食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)]的相对丰度达到了82%以上;采用改进的分离培养基分离出酸败黄酒中的难培养污染微生物36株;利用耐酸乳杆菌rec A基因和食果糖乳杆菌tuf基因的特异性引物准确鉴定出这些微生物菌株为28株耐酸乳杆菌和8株食果糖乳杆菌;将两种主要酸败微生物接入到未发生酸败的黄酒中,培养2周后能够显著提高黄酒酸度。【结论】基于高通量测序的未培养技术可作为食品中难培养污染微生物快速分析的有效方法。基于未培养技术和可培养技术相结合,首次解析并验证黄酒贮存过程中造成黄酒酸败的主要微生物为耐酸乳杆菌和食果糖乳杆菌。

基于比较基因组学解析耐酸乳杆菌G10的多碳源利用特征

【背景】耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)是白酒发酵过程中的优势乳酸菌,对白酒发酵具有重要作用。L.acetotolerans G10是分离自芝麻香型白酒发酵酒醅的一株能够利用多种碳源的菌株。【目的】基于全基因组测序,解析菌株G10多碳源利用机制。【方法】通过三代测序平台Oxford Nanopore完成菌株G10全基因组测序,分别利用Circlator和Prodigal对测序数据进行组装和基因预测;通过细菌基因组分析工具(bacterial pan genome analysis tool,BPGA)进行泛基因组分析。【结果】G10能够利用22种糖类及糖类衍生物,其全基因组大小为1627828 bp,含有1878个编码基因;基于Koyto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库注释获得292个碳源代谢相关基因,基于Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库注释获得44个CAZy家族的编码基因。与其他发酵食品来源的耐酸乳杆菌相比,G10基因组最小,但其总基因数量以及淀粉和蔗糖代谢相关基因数量均最多且含有426个独有基因;与发酵食品中植物乳杆菌ATCC 14917^(T)、发酵乳杆菌ATCC 14931^(T)、干酪乳杆菌ATCC 393^(T)、短乳杆菌ATCC 14869^(T)和布氏乳杆菌ATCC 4005^(T)等其他主要代表性乳酸菌相比,G10基因组最小,碳水化合物代谢相关基因数占比最高,而且具有glvA、malP和glvC等独有基因。【结论】L.acetotolerans G10底物选择范围广,可利用多种碳源,能够适应碳源种类多变的发酵环境,对L.acetotolerans G10基因组信息的分析为进一步阐明L.acetotolerans的发酵性能提供了遗传学基础。

多粮浓香型白酒中特征酵母菌与耐酸乳杆菌的关系

【背景】多菌种协同代谢是浓香型白酒发酵的根本特征之一。【目的】探究多粮浓香型白酒发酵过程中功能微生物菌株间的相互协作关系,为实现发酵过程优化提供理论基础。【方法】采用传统分离培养法获得了多粮浓香型白酒发酵过程中的特征酵母菌和耐酸乳杆菌,并探讨了共培养过程中菌株的相互关系以及主要挥发性代谢产物的变化。【结果】共分离到3株优势特征性酵母菌(KazachstaniahumilisZ1、PichiakudriavzeviiZ2、CandidaethanolicaZ3)和1株耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans W)。K.humilis Z1和L.acetotolerans W共培养体系中耐酸乳杆菌数量明显少于纯培养L.acetotolerans W的菌体数量;3株酵母菌均一定程度抑制L.acetotolerans W产乳酸,K.humilis Z1能抑制L.acetotolerans W不产乳酸;K.humilis Z1纯培养与Z1&W共培养体系的挥发性代谢产物的构成相似;纯培养P.kudriavzevii Z2与Z2&W共培养体系的挥发性代谢产物差异明显,主要表现为共培养时乙酸乙酯和乳酸乙酯含量显著增加。【结论】在共培养体系条件下,产乙醇酵母菌对耐酸乳杆菌的乳酸代谢有抑制作用,而耐酸乳杆菌又对酵母菌的乙醇代谢有一定影响,这对多粮浓香型白酒品质调控和菌群间相互关系具有重要意义。