乙酰胆碱门控氯离子通道受体突变影响秀丽线虫运动学和运动状态转换

目的 乙酰胆碱作为一种高度保守的神经递质,在动物的运动行为调控中起着至关重要的作用。乙酰胆碱信号转导异常可导致多种运动功能障碍。然而,乙酰胆碱在运动行为中的抑制性调控机制尚未完全清楚。本文以秀丽隐杆线虫为研究对象,探究乙酰胆碱门控氯离子通道受体亚基(ACC-1、ACC-2、ACC-3、ACC-4)在运动行为中的调控作用。方法 通过将运动追踪、分子遗传学和光遗传学技术相结合,对乙酰胆碱门控氯离子通道受体亚基突变线虫的运动进行分析。结果 研究发现,这些亚基突变会影响线虫前进、后退和转向运动的运动学特征,并且前进过程中线虫身体弯曲幅度也发生了变化。在这些突变线虫的后退过程中光激活RIB中间神经元会导致后退运动延迟终止。结论 这些结果提示,乙酰胆碱门控氯离子通道亚基的调控作用对于维持和调节秀丽隐杆线虫运动状态是必需的。同时,这些亚基可能参与介导RIB中间神经元在秀丽隐杆线虫后退运动中的抑制性调控。本研究为理解乙酰胆碱门控抑制性受体在运动行为中的调控机制提供了新的思路。

蛋白质酪氨酸磷酸化和氯通道参与瞬时受体电位蛋白介导钙池耗竭引起的钙内流

目的 探讨蛋白质酪氨酸磷酸化与Cl-通道对瞬时受体电位 (TRP)蛋白参与的Ca2 + 池耗竭引起的Ca2 + 内流(SOC)的调控作用。方法 采用脂质体转染和Fura 2 /AM荧光光度法 ,测定胞浆游离Ca2 +浓度 ( [Ca2 + ]i) ,比较转染人源性TRP1 (hTRP1 )和人源性TRP3 (hTRP3 )cDNA对毒胡罗卜素 (TG)引起的Ca2 + 内流的作用 ,并观察酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮、Cl-通道阻断剂呋塞米和 4,4 二异硫氰基芪 2 ,2 二磺酸 (DIDS)对其的影响。结果 HEK2 93细胞转染hTRP1cDNA后 ,TG引起的Ca2 + 内流显著增加 ;转染hTRP3cDNA则无明显影响。 5～ 3 0 μmol·L-1染料木黄酮、1～ 8μmol·L-1呋塞米、0 .5～ 1μmol·L-1DIDS对转染hTRP1cDNA细胞的TG诱发的Ca2 + 内流均有抑制作用。结论 hTRP1蛋白可能是HEK2 93细胞SOC的物质基础 ;酪氨酸激酶和Cl-通道均参与HEK2 93细胞SOC的调控 。

血管内皮细胞上钙通道与氯通道功能研究进展

血管内皮细胞属于非兴奋性细胞,覆于血管腔内表面,其胞浆膜富含离子通道,构成其独特的信号传导功能的物质基础,本文综述了近年来有关内皮细胞上钙离子和氯离子通道在内皮细胞功能中的角色的研究,以期能够进一步探讨心血管疾病与离子通道功能异常之间的关系。

GABA_A受体激动剂对AD模型配体门控氯通道的作用

目的观察并分析GABA_A受体激动剂蝇蕈醇对GABA激活的配体门控氯通道的作用,为寻找新的抗阿尔茨海默病(AD)药物提供实验依据。方法 Aβ_(1-42)诱导海马神经细胞作为AD细胞模型;通过膜片钳(Patch clamp)技术在大鼠海马神经元上记录配体门控氯通道瞬时外向电流,采用非特异性氯通道阻断剂(NFA)和无GABA的细胞外液确定该电流成份为瞬时外向氯电流;通过膜片钳技术观察GABA_A受体激动剂蝇蕈醇对于在大鼠海马神经元上记录瞬时外向电流的作用;向AD细胞模型中加入GABA_A受体激动剂,采用MTT观察各组细胞活力。结果加入GABA_A受体激动剂蝇蕈醇后GABA激活氯电流强度增加;加入浓度为1 mmol/L蝇蕈醇的AD模型细胞组存活率为(91.32±3.73)%,略高于未加入蝇蕈醇的模型细胞组,两组对比P>0.05。结论 GABA_A受体激动剂蝇蕈醇对于AD细胞模型具有保护作用。

海洋硫酸多糖DPS对大鼠主动脉平滑肌细胞膜电压依赖性Ca^(2+)通道和受体活化性Ca^(2+)通道的影响

本文观察了海洋硫酸多糖DPS对去甲肾上腺素（NA）和氯化钾（KCl）所致大鼠主动脉环收缩反应的影响。结果表明,DPS 1mg·L-1能抑制NA和KCl所致大鼠主动脉环收缩,使量效反应曲线非平行性右移,压低最大反应曲线,显示DPS对NA和KCl所致大鼠主动脉环收缩具有非竞争性拮抗作用。提示,DPS有抑制电压依赖性Ca2+通道和受体活化性Ca2+通道的作用。

ATP激活鼻咽癌细胞氯电流并减小细胞容积(英文)

采用全细胞膜片钳技术和细胞容积测量技术,在低分化鼻咽癌细胞株CNE-2Z上观察ATP 诱导的Cl- 电流的特性及其对细胞容积的影响。细胞外微摩尔水平的ATP 以剂量依赖性的方式激活一个具有弱外向整流特性,没有时间依赖性失活的电流,此电流的反转电位 [(-0.05 ± 0.03) mV]接近Cl- 的平衡电位(-0.9 mV)。用葡萄糖酸置换细胞外液Cl- 后, ATP 激活的电流明显减小并且反转电位发生改变。氯通道抑制剂NPPB (200 μmol/L)可以抑制这一电流 [(81.03 ± 9.3)%] 。此电流亦可被嘌呤受体(P2Y) 拮抗剂反应蓝 2 抑制 [(67.39 ± 5.06)%]。50 μmol/L 的 ATP 使在等渗状态下的细胞容积缩小, 替代和耗竭细胞外、内的Cl- 后, ATP 的这一作用消失。这些结果提示细胞外微摩尔水平的 ATP 可通过兴奋 P2Y 受体激活氯通道而产生与细胞容积调节相关的Cl- 电流。

AngⅡ对血管平滑肌细胞ANO1表达的影响及机制

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙激活氯通道ANO1蛋白表达的影响及其受体机制。方法用不同浓度(1、10、100、500、1000 nmol/L)AngⅡ处理VSMCs 24 h或用100 nmol/L AngⅡ处理VSMCs不同时间(1、6、12、24、48 h),观察AngⅡ对ANO1表达的影响。AngⅡ处理(100 nmol/L,24 h)前分别加入血管紧张素Ⅰ型受体(AT1R)阻断剂氯沙坦钾(LP)和血管紧张素Ⅱ型受体(AT2R)阻断剂PD123319(PD),进一步探讨AngⅡ作用的受体机制。以组织贴块法进行大鼠VSMCs的原代培养,采用Western blot法检测ANO1蛋白表达水平。结果与对照组相比,以10~1000 nmol/L AngⅡ处理24 h可明显提高细胞中ANO1蛋白表达水平,其中以100 nmol/L AngⅡ的作用最为显著(F=18.56,P<0.01);与对照组相比较,以100 nmol/L AngⅡ处理12~48 h可显著上调细胞中ANO1蛋白的表达(F=10.84,P<0.01)。AT1R阻断剂LP可完全阻断AngⅡ诱导的ANO1表达(F=9.68,P<0.05),而AT2R阻断剂PD无此作用。结论AngⅡ以浓度和时间依赖性的方式显著上调VSMCs中ANO1蛋白的表达,该作用是通过AngⅡ与AT1R结合而实现的。

氯化锂对Aβ1-42引起的星形胶质细胞谷氨酸释放的抑制作用及其对海马神经元损伤的保护作用

目的:研究氯化锂对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)引起的星形胶质细胞(AS)谷氨酸释放的抑制作用,并探讨其对海马神经元损伤的保护作用及机制。方法:原代培养AS及海马神经元,AS分为对照组和Aβ1-42+不同剂量氯化锂组(分别加入0.25、0.50和1.00 mmol∙L-1氯化锂作用2周,加入250 nmol∙L-1 Aβ1-42刺激),采用荧光探针技术检测AS中Ca^2+水平,采用高效液相色谱法检测AS谷氨酸的释放量,Western blotting法检测AS中瞬时受体电位通道蛋白1(TRPC1)、钠-钙交换蛋白1(NCX1)和电压门控钙离子通道(Cav1.2)蛋白表达水平。海马神经元成熟化后分为对照组、Aβ1-42组和Aβ1-42+不同剂量氯化锂组,加入Aβ1-42处理的含AS的条件培养基(ACM)培养并以不含AS的条件培养基为对照,倒置相差显微镜下观察海马神经元突起总长度(TDBL)、一级突起数(PDN)和最大分支级数(MBO),Griess法测定培养液中一氧化氮(NO)释放量。结果:与对照组比较,Aβ1-42+不同剂量氯化锂组AS中Ca^2+水平明显降低(P<0.05),Ca^2+再充功能降低(P<0.05),谷氨酸释放量明显减少(P<0.05),TRPC1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),NCX1和Cav1.2蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,Aβ1-42组海马神经元NO释放量明显增加(P<0.05),TDBL、PDN和MBO明显减少(P<0.01);与Aβ1-42组比较,Aβ1-42+不同剂量氯化锂组海马神经元NO释放量明显减少(P<0.01),TDBL、PDN和MBO明显增加(P<0.05或P<0.01)。加入Aβ1-42处理的不含AS的培养基培养,各组海马神经元NO释放量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:氯化锂对Aβ1-42引起的AS中Ca^2+依赖的谷氨酸释放具有抑制作用,该作用机制可能与其下调TRPC1受体表达有关,氯化锂可通过抑制神经元中NO的释放减轻海马神经元的损伤。

Poly(A)^+mRNA翻译产生的GABA受体-氯离子通道复合体

采用生化药理学方法首次在注射了胚鸡脑poly(A)^+mRNA的非洲爪蟾卵母细胞表面检测到GABA受体复合体,从生化角度证实了移植GABA受体、安定受体的结合部位及其功能部位氯离子通道的存在。注射Barth液和poly(A)RNA的卵母细胞不能表达此受体复合体。放射性配体结合实验中,〔~3H〕FNZP终浓度高于0.6nmol/L时,结合趋于饱和,K_D=1.17nmol/L,B_(max)=1.5fmol/cell。此结合可被过量的氟安定抑制,而不受QNB的影响。蝇蕈醇(20μmol/L),内源性GABA受体激动剂(19μg/μl),苯巴比妥(500μmol/L)可以增强移植安定受体与〔~3H〕FNZP的结合。GABA(2μmol/L)及低浓度的印防己毒素(50μmol/L)对结合无影响,较高浓度(125μmol/L)的印防己毒素对结合有抑制作用。

中性粒细胞离子通道及其功能的研究进展

中性粒细胞作为免疫吞噬细胞,参与许多生理及病理过程,如炎症反应,吞噬病原体,清除肿瘤细胞,清除坏死组织碎片等,这些生理功能与中性粒细胞的离子通道密切相关。本文综述了中性粒细胞上存在的不同类型的离子通道及其在中性粒细胞中的作用,包括电压门控质子通道、钾通道、ATP门控P2X;通道以及氯通道等。着重阐述中性粒细胞离子通道介导的离子电导,并总结了每个通道所介导和参与的中性粒细胞中的病理过程。从功能的角度讨论最近的发现,以期待对疾病治疗靶点的选择有所帮助。

TGF-β1受体对ClC-3氯通道在正畸骨代谢中表达的影响

目的观察TGF-β1受体(TGF-β1 receptor,TβR)对成骨细胞中ClC-3氯通道表达的影响,初步探索TβR在ClC-3氯通道调控细胞成骨分化中的作用。方法通过CCK-8试剂盒法和Real-Time PCR法检测TβR抑制剂在MC3T3-E1细胞中对TβRⅠ、TβRⅡ表达的最佳抑制方式;观察阻断TβR对ClC-3氯通道表达的影响,以及通过siRNA基因转染技术阻断ClC-3氯通道观察对TβRⅠ、TβRⅡ表达的影响;并观察TβR对成骨相关基因(Alp、Runx2)表达的影响。结果浓度为2μmol/L的TβR抑制剂作用MC3T3-E1细胞24 h对TβRⅠ、TβRⅡ表达抑制作用较好,并且对细胞的毒性作用较小。抑制TβR表达可促进ClC-3基因和蛋白的表达(P<0.05),同样下调ClC-3氯通道的表达,TβRⅠ和TβRⅡ基因的表达升高(P<0.05),TβRⅡ升高程度强于TβRⅠ。阻断TβR可促进成Alp、Runx2的表达(P<0.05)。结论TβR可抑制骨代谢过程中ClC-3氯通道在成骨细胞中的表达,TβRⅡ对ClC-3氯通道的表达更敏感。

γ-氨基丁酸门控氯离子通道受体及其靶标杀虫剂

作为半胱氨酸环配体门控离子通道超家族成员之一,γ-氨基丁酸门控氯离子通道(GABA-Cl)主要介导神经系统快速抑制性神经传递。由于其在昆虫和脊椎动物体内存在显著差异,GABA-Cl受体成为了现代杀虫剂研发的理想靶标。对GABA-Cl受体的结构和功能进行介绍,并对其靶标杀虫剂的研发背景与现状、化学合成、作用机制、生物活性与安全性进行总结,旨在为GABA-Cl受体靶标杀虫剂的研究、开发和应用提供指导。

基于CaCC的TRPV4调节剂高通量筛选细胞模型的建立

目的构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型。方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况。应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性。加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca2+浓度;通过Z'因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选。结果RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4。倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型。荧光淬灭动力学实验结果显示,该模型可以筛选TRPV4调节剂,斜率(Slope)值与TRPV4调节剂的浓度呈剂量依赖关系;该模型可敏感检测细胞内Ca2+的浓度变化,通过Slope值可反映细胞内Ca2+浓度的高低;Z'因子为0.728,表明该模型可高通量筛选TRPV4调节剂。结论成功构建了一种可以敏感高效筛选TRPV4调节剂的高通量筛选细胞模型。

辣木籽油对人小脑颗粒细胞氯离子通道的影响

【目的】探究辣木籽油对人小脑颗粒细胞γ-氨基丁酸受体(GABAA)细胞膜氯离子通道的影响。【方法】首先利用冷榨法制得辣木籽油,通过连续培养人小脑颗粒细胞(human cerebellar granule cells,HCGC),采用CCK8法检测辣木籽油对细胞活力的影响,14 d后表达功能性GABAA受体,经不同剂量(2、4、8μg/mL)辣木籽油、油酸、β-谷甾醇、豆甾醇处理,空白组给予生理盐水,阳性药给予戊巴比妥钠(10 mmol/L),最后采用N,N二甲基二吖啶硝酸盐(MQAE)荧光探针检测小脑颗粒细胞内的氯离子浓度。【结果】辣木籽油等样品在10μg/mL浓度以下对细胞活力没有任何影响;与空白组相比,辣木籽油(4、8μg/mL)、油酸(4、8μg/mL)、豆甾醇(4、8μg/mL)及β-谷甾醇(8μg/mL)对HCGC细胞以剂量依赖方式激活氯离子通道,且具有统计学差异(P<0.05)。此外,阳性药戊巴比妥钠(10 mmol/L)亦可激活HCGC细胞的氯离子通道,并具有统计学差异(P<0.01)。【结论】证明辣木籽油体外抑制神经元兴奋与GABA神经系统有关。

基于CaCC的P2ry2调节剂细胞筛选模型的建立及应用

目的:构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的高通量P2Y2嘌呤受体(P2ry2)调节剂细胞筛选模型。方法:采用RT-PCR方法验证Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮细胞(FRT细胞)中P2ry2的mRNA表达水平,切胶回收PCR扩增产物并进行序列测序和比对,进一步应用Western blot检测FRT细胞的P2ry2蛋白表达水平。构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体,应用脂质体转染、抗生素筛选和有限稀释,获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。采用倒置荧光显微镜观察共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞的情况,并应用荧光淬灭动力学实验验证模型的有效性;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂,并应用Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内游离钙的变化,探究胞内Ca2+浓度与P2ry2调节剂的剂量依赖关系;用Z'因子评价本模型的稳定性和可重复性。结果:FRT细胞内源性表达P2ry2;倒置荧光显微镜中观察到ANO1在细胞膜上表达绿色荧光,YFP-H148Q/I152L在胞浆中表达绿色荧光,成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的细胞模型;荧光淬灭动力学实验证实该细胞模型可筛选P2ry2调节剂,应用Fura-2表明该细胞模型可敏感地检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca2+浓度与P2ry2调节剂及相对荧光强度呈剂量依赖关系;Z'因子为0.75,说明该细胞模型可以高通量筛选P2ry2的调节剂且有良好的稳定性与可重复性。结论:成功构建了一种经济简便快捷高效的P2ry2调节剂细胞筛选模型,适用于P2ry2调节剂的发现与评价。

Relationship between adenosine-induced vascular effects and ATP-sensitive K^+ channels

目的：研究大鼠主动脉腺苷受体和腺苷三磷酸（ＡＴＰ）敏感性钾通道间的关系．方法：在离体大鼠主动脉环上观察内皮完整和内皮去除后腺苷受体介导的血管效应及吡那地尔与格列苯脲对腺苷作用的影响．结果：腺苷３－３００μｍｏｌ·Ｌ－１浓度依赖地松弛ＫＣｌ２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１预收缩的离体大鼠主动脉环，在４８／９９的标本，腺苷产生先短暂收缩后持续舒张的双向反应．格列本脲１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１阻断ＡＴＰ敏感性钾通道后腺苷的舒张作用被取消而收缩作用仍存在；腺苷１００μｍｏｌ·Ｌ－１与吡那地尔１μｍｏｌ·Ｌ－１合用时未产生协同作用；去除内皮不影响腺苷的缩血管效应，但舒血管作用减弱且变慢．结论：ＡＴＰ敏感性钾通道的激活参与腺苷受体介导血管扩张作用，但与血管收缩无关．

异戊酸对非洲爪蟾卵母细胞膜上α1甘氨酸受体氯离子通道电流的影响

目的探讨异戊酸对甘氨酸受体氯离子通道的影响。方法采用微注射法在非洲爪蟾卵母细胞核中注射α1甘氨酸受体cDNA,在细胞膜上过度表达甘氨酸受体后,采用双电极全细胞膜片钳技术测定异戊酸对该受体氯离子通道电流变化的影响。结果5．0～20 mmol/L异戊酸可增强卵母细胞膜上甘氨酸受体氯离子通道内流电流（19%～187%,P＜0．01）,且呈浓度依赖性。结论异戊酸对α1甘氨酸受体氯离子通道电流有增强作用,其镇静催眠作用的机制可能与此有关。

GPCR和CaCC信号传导中的钙信号网络

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)作为最大的一类人膜蛋白受体家族和最重要的药物靶标而倍受关注,其中钙离子在细胞内信号传导级联放大中起了关键的作用。阐述了GPCR和钙激活的氯离子通道蛋白(calcium-activated chloride channel,CaCC)中的钙信号网络与生理功能以及如何干扰阻断该网络,为药物设计和很多疾病的治疗提供了依据。

基于CFTR的H2受体调节剂高通量筛选细胞模型的构建

目的建立基于囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)高通量筛选组胺H2受体(histocompatibility-2)调节剂的模型。方法应用RT-PCR、Western blot检测H2受体在Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中表达情况。采用脂质体转染获取同时表达CFTR和黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。荧光淬灭动力学实验检测细胞模型功能,判断该模型是否可以筛选H2受体的调节剂。结果 RT-PCR、Western blot结果显示,FRT内源性表达H2受体。采用倒置荧光显微镜观察,证实成功构建同时表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的细胞模型。荧光淬灭动力学实验证明该模型具有cAMP激活氯离子通道的特性,可用于H2受体调节剂的筛选,且荧光斜率(slope)值与H2受体调节剂的浓度呈剂量依赖关系。结论成功构建基于CFTR高通量筛选H2受体调节剂的细胞模型。

基于钙激活氯离子通道靶向M_(3)受体的药物筛选细胞模型的建立

目的建立一种基于钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channel,CaCC)靶向M3受体(cholinergic receptor muscarinic 3,Chrm3)高效敏感的药物细胞筛选模型和方法。方法RT-PCR、免疫荧光技术及Western blot检测Chrm3在FRT细胞中的表达情况;构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(anoctamin 1,ANO1)和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(Fischer rat thyroid,FRT)细胞模型,倒置荧光显微镜和荧光淬灭动力学实验鉴定CaCC细胞模型有效性;Fura-2荧光探针法检测加入Chrm3激活剂后胞浆内的钙浓度,荧光淬灭动力学实验验证细胞模型可筛选Chrm3调节剂;Z'因子评估该细胞模型是否适用于高通量筛选。结果FRT细胞在mRNA及蛋白水平均内源性表达Chrm3;成功构建了稳定共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型;该细胞模型可敏感检测细胞内钙浓度,相对荧光强度变化值与Chrm3调节剂浓度成剂量依赖关系,可用于Chrm3调节剂的筛选;该模型的Z'因子值为0.678,满足高通量筛选的要求。结论此细胞模型通过敏感检测钙信号实现了对Chrm3调节剂的高通量筛选,也可应用于对其他与钙离子信号相关G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)靶点的筛选。