毕赤酵母表达重组红林蚁AChE高密度发酵工艺研究

【目的】优化毕赤酵母高密度生产重组红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)的发酵条件,为AChE在农药残留检测中应用提供酶源。【方法】采用毕赤酵母表达系统,选用高表达AChE的重组子X33/pPICZαAAChE,对毕赤酵母高密度生产重组红林蚁AChE的发酵条件进行优化,确定最佳发酵pH值、温度、溶解氧、补料流加速率等因素。【结果】毕赤酵母表达重组红林蚁AChE高密度发酵工艺的最佳参数:pH5.0、溶解氧30%、温度29℃、转速500 r/min、罐压0.06 MPa,甲醇诱导72~96 h时发酵液上清AChE活性增长最快。从发酵结果看,发酵结束菌体湿重可达280 mg/mL,发酵罐内甲醇诱导96 h酶活性最高,达6 000 U/mL,是摇瓶诱导表达的8倍。【结论】毕赤酵母表达系统最佳发酵工艺能实现红林蚁AChE的高密度发酵生产,降低AChE提取成本。

马醉木二萜成分及其乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

为研究马醉木叶中的二萜成分及其乙酰胆碱酯酶抑制活性,该研究根据薄层色谱显色特征,使用硅胶、MCI和半制备高效液相等色谱技术对其进行分离与纯化,并通过波谱数据(NMR和MS)分析且结合文献报道数据进行对比,鉴定了所得化合物的结构,同时采用Ellman法首次对其乙酰胆碱酯酶抑制活性进行评价。结果表明:从马醉木叶中分离并鉴定了8个二萜化合物,分别是pierisformoside F(1)、3-epi-grayanotoxinⅩⅧ(2)、3-epi-grayanotoxin B(3)、asebotoxin-X(4)、pierisformosin B(5)、asebotoxinⅢ(6)、rhodojaponinⅢ(7)和pierisformosin C(8)。其中,化合物1为首次从该植物中分离得到,化合物8表现出乙酰胆碱酯酶抑制活性。综上表明,马醉木中含有丰富的二萜成分和活性成分。该研究结果丰富了马醉木的化学成分多样性,为其后续综合开发和利用提供了一定的理论依据,也为寻求更多的活性成分提供了借鉴。

甘草不同溶剂提取物对AChE、ACE以及α-葡萄糖苷酶的抑制活性和对亚硝酸根清除活性的研究

目的:研究甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶(ACh E)、血管紧张素转化酶(ACE)活性的影响以及对亚硝酸根离子的清除能力。方法:采用高效液相色谱法测定甘草不同溶剂提取物对ACE的抑制作用,采用分光光度法测定其对α-葡萄糖苷酶、ACh E的抑制作用及对亚硝酸根离子的清除能力。结果表明:甘草石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物均对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用,其IC_(50)值分别为3.212、0.151、0.891 mg/m L,优于阳性药阿卡波糖;甘草提取物乙酸乙酯部位、水部位对ACh E有较强的抑制作用,其IC_(50)值为0.489、0.872 mg/m L,优于阳性药利斯的明;甘草乙酸乙酯提取物对亚硝酸根离子有较强的清除能力,其IC_(50)值为1.068 mg/m L,优于阳性药V_C;甘草乙酸乙酯提取物对ACE有较强的抑制作用,其IC_(50)值为0.815 mg/m L,优于其阳性药卡托普利。在这5种甘草不同溶剂提取物中,甘草乙酸乙酯提取物抑制活性最强。结论:甘草乙酸乙酯提取物具有很强的α-葡萄糖苷酶、ACh E、ACE抑制作用且对亚硝酸离子有很好的清除能力。

落叶松毛虫AChE最佳反应体系建立及其对3种杀虫剂敏感性比较

通过正交试验和酶活性测定法研究了落叶松毛虫6龄幼虫乙酰胆碱酯酶(AChE)最佳反应体系及对3种杀虫剂的敏感性。结果表明:落叶松毛虫6龄幼虫AChE最佳反应条件为酶液质量浓度0.2g/mL、底物浓度0.8mmol/L、反应体系pH7.5、水浴温度35℃和反应时间5min。敌敌畏、高效氯氟氰菊酯和阿维菌素对落叶松毛虫6龄幼虫体外AChE活性产生不同的抑制作用,且抑制效应与杀虫剂呈现明显的剂量--效应关系;其中敌敌畏抑制效果最显著(IC50=3.018×10-4mg/mL),其次是高效氯氟氰菊酯(IC50=1.436×10-2mg/mL),而阿维菌素对AChE活性抑制效果最弱。

靶标酶AChE作为筛选模型的规范化研究

以美洲大蠊（ＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａＬ）中枢神经系统的乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）作为筛选模型，采用Ｇｏｒｕｎ等改进的Ｅｌｌｍａｎ比色法，建立测定ＡＣｈＥ比活力的条件并改进，使方法规范化，在国内外尚无报导．并且初步测定２０个Ｎ－甲基取代苯基氨基甲酸脂类化合物对ＡＣｈＥ抑制活力，其差异显著，可用于追踪、检测和评估生物活性．此法的优点是灵敏度高、重复性强、省药省时，可为定向合成靶标的抑制性物质和构效关系的研究提供信息和科学依据．

Fe^(3+)对泥鳅脑组织AChE活性的影响

以泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为材料,比较了脑、肠、肝脏和胰脏的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase,AChE)活性,然后采用体内染毒的方法,研究Fe3+对脑组织AChE活性的影响。结果表明,1%组织匀浆液中,脑、肠、肝脏、胰脏组织中AChE活性分别是1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg;14 d后,与对照组相比,在60 mg/L Fe3+溶液中,泥鳅脑组织中AChE活性显著降低(P<0.05),表明Fe3+对泥鳅具有神经毒性。

鲫鱼脑AChE制备及对几种有机磷农药敏感性研究

乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物神经兴奋传导中的一种关键性酶。有机磷农药能够磷酰化AChE活性中心的丝氨酸羟基,导致神经传导阻断,因此AChE是有机磷农药残留检测的靶酶。文章选择鲫鱼脑作为酶源,对AChE提取方法进行了研究,并探讨了其对有机磷农药的敏感性。首先粗提AChE,通过正交试验确定了AChE酶活测定的最佳条件,研究了粗酶对几种有机磷农药的敏感性及检测限,之后通过层析方法纯化AChE,得到高活性的目标酶。研究表明AChE活性测定最佳条件为:200mmol/L底物、pH8.0、30℃水浴30min,这些因素对酶得活性影响顺序为:底物浓度>pH>温度>时间,酶剂量对其影响最小;由鲫鱼脑粗提得到的AChE对4种有机磷农药的敏感性为:敌敌畏>敌百虫>氧乐果>三唑磷>辛硫磷>乙酰甲胺磷;纯化后酶活达到了458.43μmo(lmin·mg),适合用于有机磷农药检测。

全缘兔耳草不同萃取部位黄酮和环烯醚萜苷含量及其抗氧化和抗AChE活性研究

为研究全缘兔耳草不同萃取部位黄酮和环烯醚萜苷含量及其抗氧化和抗乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性,采用紫外可见分光光度法测定全缘兔耳草不同萃取部位黄酮和环烯醚萜苷含量。以加兰他敏为阳性对照,采用AChE抑制试验,评价不同萃取部位AChE抑制活性。以维生素C为阳性对照,采用DPPH和ABTS法评价不同萃取部位抗氧化活性。结果表明:乙酸乙酯部位和正丁醇部位黄酮和环烯醚萜苷含量显著高于石油醚部位;乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗氧化和抗AChE活性也显著高于石油醚部位。皮尔森相关分析表明,全缘兔耳草黄酮和环烯醚萜苷含量与抗氧化和AChE抑制活性呈显著的正相关,提示黄酮类和环烯醚萜苷类成分可能是全缘兔耳草发挥抗氧化和抑制AChE作用的活性成分。

黄饭花对α-葡萄糖苷酶、AChE和亚硝酸根的抑制活性研究

研究黄饭花不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和对亚硝酸根离子的清除能力。结果表明黄饭花60%乙醇提取物、乙酸乙酯部位提取物和正丁醇部位提取物的抑制α-葡萄糖苷酶活性强于阳性对照阿卡波糖(IC50=2.998 mg/m L),其IC50值为1.640、0.952、1.900 mg/m L;黄饭花乙酸乙酯部位提取物对乙酰胆碱酶(acetyl cholinesterase,ACh E)的抑制作用效果强于阳性对照利斯的明(IC50=0.745 mg/m L),其IC50值为0.503 mg/m L;黄饭花乙酸乙酯部位提取物对亚硝酸根离子的清除活性约高于阳性对照VC(IC50=1.199 mg/m L),其IC50值为1.079 mg/m L。黄饭花乙酸乙酯部位的提取物具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶和ACh E活性及清除亚硝酸离子的能力。

北五味子藤茎精油EP-SFME法提取工艺优化及精油主要成分和抗氧化活性测定

为了解决传统精油提取工艺时间长、效率低、耗能高和成本高等问题,采用酶解预处理联合无溶剂微波法(EP-SFME)提取北五味子藤茎精油,依据单因素实验和响应面法,优化获得最佳提取工艺,通过二次回归模型考察微波功率、酶解温度、微波时间对北五味子藤茎精油产量的影响,并进行试验验证。同时,对北五味子藤茎精油进行了成分组成、抗氧化以及乙酰胆碱酯酶抑制活性分析。结果表明:通过二次多项式回归模型,试验失拟项F值为1.29,P值为0.3916,表明该模型拟合良好。决定系数(R~2)为0.9833,预测R~2为0.8551,表明预测值与实际值相关度较高,模型可应用于分析和预测北五味子藤茎精油产量。在最优工艺条件(酶解温度为50℃,微波功率为480 W,微波时间为45 min,酶用量为2%,酶解时间为2 h)下,北五味子藤茎精油产量为(3.21±0.03)mg/g。气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析结果表明,新鲜北五味子藤茎精油的主要活性成分是橙花叔醇、β-榄香烯和4-萜醇。在EP-SFME法提取的精油中,这3种主要成分的相对质量分数最高,特别是橙花叔醇的相对质量分数是水蒸气蒸馏法(SD)的2.09倍。另外,EP-SFME法提取的精油中的含氧化合物峰面积占比为33.02%,比SD法(15.63%)高17.39%。与SD法相比,EP-SFME法提取新鲜北五味子藤茎精油具有更强的抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性。EP-SFME是一种更具有优势的提取新鲜北五味子藤茎精油的方法。

海洋放线菌Actinoplanes sp.M4I6化学成分研究

对海洋放线菌Actinoplanes sp.M4I6的次生代谢产物进行分离鉴定,并评价了其生物活性。采用正相硅胶柱色谱、反相C18柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术进行分离纯化,运用核磁共振波谱技术对分离所得化合物进行结构鉴定。对分离得到化合物进行了抗枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)和抑制乙酰胆碱酯酶活性评价。共分离得到9个化合物,经鉴定为(E)-prop-1-enyl-2-hydroxypropanoate(1)、cyclo-(R-Pro-R-Phe)(2)、cyclo-(L-Val-L-Leu)(3)、cyclo-(L-Phe-L-Val)(4)、cyclo-(L-Leu-L-Phe)(5)、lumichrome(6)、2-(4-hydroxyphenyl)ethylacetate(7)、4-hydroxysattabacin(8)、3-hydroxybutan-2-yl 2-phenylacetate(9),其中化合物1为新天然产物。化合物5、6、8、9对Bacillus subtilis ATCC 6633有一定的抑制活性,化合物4、6对乙酰胆碱酯酶有较弱的抑制活性。

秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究

以秦岭无病害健康桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌为研究对象,采用萃取法从菌丝中分离活性代谢产物,并对其结构进行鉴定,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测了代谢产物的细胞毒活性,采用Ellman光度法检测了代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性,并检测了代谢产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明,在桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌代谢产物中分离并鉴定了10个萜类化合物,其中化合物1-1、1-2、1-3和1-4为新化合物。化合物1-3、1-4和1-8对A549、HeLa和HepG2细胞均表现出明显的细胞毒活性;化合物1-3对乙酰胆碱酯酶表现出较强的抑制活性;化合物1-1、1-2、1-3和1-4对α-葡萄糖苷酶均未表现出明显的抑制活性。表明,基于桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌分离出具有抗肿瘤活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性的萜类化合物,为桃儿七内生真菌用于抗肿瘤及治疗阿尔兹海默病新药开发提供了新思路。

绶草中活性成分Spiranthol-A的快速制备及抑制乙酰胆碱酯酶活性研究

为建立“大孔吸附树脂柱色谱-凝胶柱色谱-HPLC”三步法快速制备绶草中活性成分Spiranthol-A方法,并评价其抑制乙酰胆碱酯酶活性,在HPLC导向下,将绶草95%乙醇提取物先经大孔吸附树脂柱色谱分离得到含Spiranthol-A部位,再通过Sephadex-LH 20柱色谱和HPLC纯化,得单体化合物Spiranthol-A;采用微孔板法评价Spiranthol-A体外抑制乙酰胆碱酯酶活性。结果表明:Spiranthol-A纯度较高且抑制乙酰胆碱酯酶活性较强,IC_(50)值仅为(10.58±0.44)μg·mL^(-1)。综上,该研究所建立的快速制备Spiranthol-A方法具有一定的应用前景,且Spiranthol-A具有显著抑制乙酰胆碱酯酶作用,值得深入研究。

Synthesis and Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Polymethoxyflavone Mannich Base Derivatives

A series of novel polymethoxyflavone Marmich base derivatives 1--8 was synthesized by Mannich reaction of 5-hydroxy-3,7,3＇,4＇-tetramethoxyflavone 9 with various secondary aliphatic amines and formaldehyde. Their acetylcholmesterase（AChE） inhibitory activities were evaluated. The results showed that most of them exhibited AChE inhibitory activity and especially piperidin-l-yl methyl substituent derivative 5（IC50=0.238 μmol/L） demon- strated stronger activity comparable with the positive control, neoeserinemethyl sulfate（IC50=1.39 μmol/L）, which is worthy of further development as an agent for Alzheimer＇s disease treatment.

国产绿奇楠沉香的化学成分研究

为了解国产绿‘奇楠’沉香的化学成分,采用色谱和波谱方法从其乙醚和乙醇提取物中分离鉴定了7个化合物,分别鉴定为顺式-7-羟基菖蒲烯(1),(5R,6R,7S,8R)-2-(苯乙基)-6,7,8-三羟基-5,6,7,8-四氢-5-[2-(2-苯乙基)色酮基-6-氧代]色酮(2), 1-羟基-1,5-二苯基戊-3-酮(3),丁香树脂酚葡萄糖苷(4),(3β)-齐墩果-12-烯-3,23-二醇(5),β-谷甾醇(6)和棕榈酸-α-单甘油酯(7)。化合物1、3～5和7均为首次从沉香中分离得到,其中化合物1表现出非常甜的芳香气味。乙酰胆碱酯酶体外抑制活性测试结果表明,50μmol L^(–1)的化合物1对乙酰胆碱酯酶抑制率为(49.9±1.4)%。

海藻组分抑制乙酰胆碱酯酶活性研究

采用乙酰胆碱酯酶抑制剂活性筛选模型对采自青岛沿海的22种海藻样品提取物的石油醚组分和乙酸乙酯组分进行了活性筛选。结果表明,22种海藻的石油醚组分均具有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中亮管藻、海头红、鸭毛藻和孔石莼表现出较强的活性,在浓度为50μg/ml时的抑制率均大于50.0%,分别为50.5%、55.5%、56.6%和65.8%;其他大部分海藻的抑制率在30.1%到48.9%之间。与石油醚组分不同的是,只有少数海藻的乙酸乙酯组分表现出乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中鸭毛藻的活性最为显著,在浓度为25μg/ml时抑制率高达71.8%;孔石莼的乙酸乙酯组分也具有较强的抑制活性;其余海藻的乙酸乙酯组分对乙酰胆碱酯酶的抑制活性较弱,有些不仅没有活性,反而表现出不同程度的增强作用。

不同蕨类植物提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的评价

为对采自浙江天目山的40种蕨类植物乙醇提取物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性研究。本文采用乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选模型。结果表明:在供试质量浓度在1 mg/mL时,40种植物的乙醇提取物均具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中密羽贯众、野雉尾金粉蕨和狗脊等13种蕨类植物表现出较强的抑制活性,抑制率均大于90%,其余大部分植物的抑制率均大于60%。而在供试质量浓度在0.025 mg/mL时,只有少数植物表现出较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中狭顶鳞毛蕨的抑制率为62.63%±3.72%,蜈松草的抑制率为48.01%±2.87%,其余大部分植物的抑制活性均小于40%,甚至有些植物提取物不仅对乙酰胆碱酯酶没有抑制活性,反而表现出一定的增强作用。

有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用及QSAR研究

以碘化硫代乙酰胆碱为底物,二硫代二硝基苯甲酸为显色剂,采用分光光度法测定了21种有机磷农药对乙酰胆碱酯酶(AChE)的半抑制浓度(IC50).运用多元线性回归分析以及参数间的自相关分析建立有机磷农药对AChE抑制作用的QSAR模型.模型分析表明,有机磷农药对AChE的抑制作用主要受特定方向上的原子极化率及原子的电拓扑状态的影响,是多因素综合作用的结果.模型可解释高达78%的数据变异和显著的预测能力(q2=0.653),表明有机磷农药对AChE的抑制作用可借助结构活性关系模型进行预测与评价.

海南栽培肾茶的化学成分研究

为了解肾茶(Clerodendranthus spicatus)的化学成分,从海南栽培肾茶地上部分分离得到11个化合物,经波谱分析分别鉴定为:吐叶醇(1)、丁香脂素(2)、3,4-二羟基苯乙醇(3)、甜橙素(4)、5,6,7,4′-四甲氧基黄酮(5)、5-羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮(6)、6-羟基-5,7,4′-三甲氧基黄酮(7)、5-羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄烷酮(8)、3,3′,5-三羟基-4′,7-二甲氧基-二氢黄酮(9)、松脂素(10)和熊果酸(11)。化合物3、9和10为首次从肾茶中分离得到。对化合物1~6进行活性测试,结果表明化合物3~5对乙酰胆碱酯酶具有一定的抑制活性。

杨梅素及其类似物抗氧化与乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

目的:探讨杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素的抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性。方法:采用DPPH自由基清除和乙酰胆碱酯酶抑制高通量筛选模型进行研究。结果:杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素清除DPPH自由基的IC50值分别为18.34、28.89、10.70μg/mL,三种化合物的抗氧化活性均强于阳性药芦丁(IC50=31.32μg/mL),其中二氢杨梅素还强于VC(IC50=14.69μg/mL);在质量浓度为0.25mg/mL时,杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为:30.66%±4.05%、38.48%±1.98%、78.81%±2.23%,其中二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶抑制作用较显著,其IC50值为1546±47.05μmol/L。结论:杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素均具有显著的DPPH自由基清除能力,本文首次报道二氢杨梅素具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性,值得进一步深入研究。