Acetylshikonin Inhibits Colorectal Cancer Growth via PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway

Background: Acetylshikonin, a major constituent isolated from Arnebia euchroma, is a potential candidate for anti-colorectal cancer drugs. However, the potential activity and underlying mechanism of Acetylshikonin against colorectal cancer remain unclear. Methods: In this study, Acetylshikonin was isolated from the active CHCl3 extract of Arnebia euchroma using activity-guided screening, and elucidated by the extensive spectroscopic analysis and comparison with literature data. Human colorectal cancer cells HT29, DLD-1, HCT116 or Caco-2 were exposed to different concentrations of Acetylshikonin (6.25 - 100 μg/mL) for 24 or 48 h. Cell viability, cell apoptosis and cell cycle distribution were detected. The activity of Acetylshikonin and potential mechanism of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway were evaluated in vitro and vivo. Results: We found that Acetylshikonin exhibited remarkable anti-proliferative activity in a dose-dependent manner against HT29 cells with the IC50 values of 60.82 μg/ml and 30.78 μg/ml at 24, 48 h, respectively. Moreover, Acetylshikonin induced cell cycle arrest at G0/G1 phase and early apoptosis through inhibition of PI3K/Akt/mTOR pathway. Furthermore, the assays of cell inhibition, early apoptosis and G0/G1 phase distribution showed that suppression of the PI3K/Akt pathway using LY294002 enhanced the anti-cancer effect of Acetylshikonin. Similarly, Acetylshikonin also decreased the growth of tumour in colorectal cancer xenografts in mice through PI3K/Akt/mTOR pathway. Conclusions: To sum up, these new findings provided a framework for further exploration of Acetylshikonin which possessed the potential antitumor activity by inhibiting PI3K/Akt/mTOR pathway.

Inhibitory effect of acetylshikonin on human gastric carcinoma cell line SGC-7901 in vitro and in vivo

AIM:To investigate the inhibitory effect of acetylshikonin on human gastric carcinoma cell line SGC-7901 and its mechanism. METHODS:MTT assay was used to assess the inhibitory effect of acetylshikonin on proliferation of SGC-7901 cells.Apopt osis-inducing effect was determined by flow cytometry and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling with Hoechst staining.Expression of mRNA and protein in Bcl-2 and Bax was analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot.Antitumor effect of acetylshikonin on a mouse SGC-7901 model was also determined. RESULTS:Forty-eight hours after treatment with acetylshikonin,MTT assay showed that acetylshikonin inhibited the proliferation of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner.The half maximal inhibitory concentration of acetylshikonin to SGC-7901 cells was 0.428±0.07 mg/L.Cell shrinkage,nuclear pyknosis and chromatin condensation,which are the characteristics of cell apoptosis,were observed in treated SGC-7901 cells and the percentage of apoptosis increased in a dose-dependent manner.Acetylshikonin downregulated the expression of Bcl-2 and up-regulated the expression of Bax in the treated SGC-7901 cells compared with the controls.The experiment in vivo showed that 0.5,1,and 2 mg/kg of acetylshikonin significantly inhibited the growth of tumor in the mouse SGC-7901 model,with an inhibitory rate of 25.00%-55.76%. CONCLUSION:Acetylshikonin inhibits the growth of SGC-7901 cells in vitro and in vivo by inducing cell apoptosis.

乙酰紫草素诱导急性髓系白血病HL-60细胞发生铁死亡的作用及分子机制

目的:探究乙酰紫草素诱导急性髓系白血病HL-60细胞发生铁死亡的作用及分子机制。方法:采用1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的乙酰紫草素干预HL-60细胞24 h和48 h,CCK-8实验检测乙酰紫草素对HL-60细胞增殖活力的影响;Western blot检测铁死亡相关蛋白[转录调节因子p53、胱氨酸/谷氨酸反向转运体(XCT)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、膜蛋白转铁蛋白受体1(TFR1/CD71)、铁蛋白重链1(FTH1)]的表达水平;采用GSH/GSSG检测试剂盒检测不同浓度乙酰紫草素干预HL-60细胞24 h后细胞内GSH、GSSG的含量变化;采用4μg/mL的乙酰紫草素和0.1μmol/L细胞铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)共同干预HL-60细胞24 h,Western blot检测铁死亡相关蛋白p53、XCT、GPX4、CD71、FTH1的表达水平。结果:与对照组和DMSO组相比,不同浓度的乙酰紫草素对HL-60细胞的增殖均具有较强的抑制作用;乙酰紫草素显著升高p53和CD71的表达水平,显著降低XCT、GPX4和FTH1的表达水平,其中4μg/mL乙酰紫草素干预HL-60细胞24 h,各蛋白表达水平变化最明显;乙酰紫草素显著减少GSH的含量(P<0.0001),显著提高GSSG/GSH的比值(P<0.0001);Fer-1将显著升高的p53和CD71以及显著降低的XCT、GPX4和FTH1的表达水平逆转。结论:乙酰紫草素一方面可能通过上调p53的表达,抑制XCT的表达,减少GSH含量,进而抑制GPX4的表达,促进HL-60细胞发生铁死亡;另一方面通过上调CD71(TFR1)的表达,下调FTH1的表达,从而影响HL-60细胞内铁稳态促进铁死亡的发生。

乙酰紫草素体外抗2型单纯疱疹病毒机理的研究

目的研究乙酰紫草素(acetylshikonin,AS)体外抗2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2,HSV-2)的活性及作用机理。方法以阿昔洛韦(acyclovir,ACV)为阳性对照药物,采用CCK-8法检测细胞活力,确定AS对成年非洲绿猴肾细胞(Vero)的最大无毒浓度;致细胞病变法和噬斑形成抑制实验测定AS对HSV-2的抗病毒活性;实时荧光定量PCR及半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)法测定病毒载量以评估AS对HSV-2复制周期不同阶段的抑制作用;透射电镜观察AS对HSV-2病毒粒子结构的影响。结果AS对Vero细胞的最大无毒浓度(maximal atoxic concentration,TC0)为3.785μmol/L,浓度为1.678~3.785μmol/L时能有效抑制HSV-2复制,减少噬斑形成,半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)为0.334μmol/L。在12和36 h,病毒释放期加入AS的实验组TCID50低于病毒感染对照组(13.43±10.04 vs.127.00±0.32;3.47±0.55 vs.5.80±0.12),差异均有统计学意义(t=8.359、4.161,P均<0.05);在12、24、36 h,AS直接灭活病毒组病毒载量低于病毒感染对照组(0.24±0.09 vs.1.35±0.07;4.46±0.06 vs.6.75±0.04;2.70±0.04 vs.5.27±0.10),差异均有统计学意义(t=9.920、33.360、24.020,P均<0.05)。此外,AS处理可导致HSV-2病毒粒子形态异常,随着AS浓度升高,作用后的HSV-2超微结构发生渐进改变。结论AS对HSV-2具有一定抗病毒效应,其机理可能为直接破坏病毒颗粒完整结构发挥抗病毒作用。

紫草抗氧化成分的提取及其活性研究

分别用石油醚、三氯甲烷和乙醇依次提取紫草成分 ,用OSI仪测定了三种提取物对猪油氧化稳定性的影响 ,发现石油醚提取成分 (LE - pet)和三氯甲烷提取成分 (LE -chl)有明显的抗氧化活性 ,添加到猪油中后 ,w =0 0 2 %时 ,猪油的氧化稳定性比空白样品提高了约 1倍。对LE -pet和LE -chl进行薄层层析分离鉴定 ,得到三种化合物 :β ,β 二甲基丙烯酰紫草醌 (Ⅰ)、乙酰紫草醌 (Ⅱ)和紫草醌 (Ⅲ)。对它们的抗氧化活性进行测试 ,化合物Ⅱ和Ⅲ表现出明显的抗氧化活性 ,当w(Ⅱ)=0 .0 6 %、w(Ⅲ) =0 0 6 %时 ,猪油的氧化稳定性分别提高了 6 0 4和 3 94倍。化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与VE均有较强的协同作用 ,化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的质量分数为 0 .0 2 %与VE 的质量分数为 0 0 2 %共同使用时 ,其抗氧化协同系数 (SE)分别为 81 4(Ⅰ)、5 2 7(Ⅱ)和 132 6 (Ⅲ )

紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10细胞增殖的协同作用

目的研究紫檀茋和乙酰紫草素对B16F10细胞的增殖抑制的协同作用与相关机制。方法通过系统药理学的方法对紫檀茋和乙酰紫草素的联合作用进行预测,并对可能靶点进行筛选及分析。体外采用MTT法测定紫檀茋、乙酰紫草素及联合用药对B16F10细胞的抑制效应;形态学水平观察细胞核的凋亡情况;流式细胞技术检测细胞凋亡及周期的变化;RT-PCR法检测细胞内相关基因的表达;体内实验采用C57BL/6小鼠移植瘤方法。结果紫檀茋有14个靶点与周期相关,乙酰紫草素有12个靶点与凋亡相关,且均有靶点与p53信号通路相关。紫檀茋、乙酰紫草素及联合用药对B16F10细胞的增殖均有抑制作用,并呈浓度剂量依赖性,并具有显著协同效果;联合给药组细胞凋亡率最高,且周期阻滞在G1期;单一给药组的p53、Bax及p21基因的表达随给药时间的延长而增加,而Bcl-2、CDK2、Cyclin E基因的表达随给药时间而减少,联合给药组p53,Bax和Bcl-2的变化差异较单独给药组显著;体内抑瘤实验给药组均有不同程度的抑瘤效果,以联合给药组抑瘤率最大。结论紫檀茋和乙酰紫草素对B16F10细胞的增殖有一定协同抑制作用,认为二者协同激活p53信号通路,诱导周期阻滞和凋亡而发挥药效。

正交试验优选紫草油提取工艺的研究

目的 :优选紫草油的制备工艺 ,以稳定紫草油的色译。方法 :以紫草素的含量为指标 ,应用L8(2 7)正交实验设计筛选紫草油的最佳制备工艺条件。结果 :最佳工艺条件为 :加 4倍花生油浸泡 12h后再煮 1h ,监测油温不超过 15 0°C ,(紫草素含量 >30 0mg % )。 结论 :紫草油中紫草素含量高 ,紫草油纱成品色泽深红 。

乙酰紫草素注射液对S180荷瘤小鼠抑瘤作用研究

目的:观察乙酰紫草素注射液对小鼠移植性肉瘤S180的抑瘤作用。方法:采用小鼠S180肉瘤模型进行体内抑瘤实验。观察荷瘤动物的生长情况,测量各实验组小鼠肿瘤体积及瘤质量变化,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。治疗结束后取各鼠肿瘤组织及重要器官HE染色,光学显微镜下观察。结果:乙酰紫草素注射液的抑瘤率分别为25.28%、39.55%、56.00%。0.5、1、2mg/kg可使肿瘤细胞大量变性坏死,各实验组小鼠重要器官未见明显异常。结论:乙酰紫草素注射液对S180荷瘤小鼠生长具有抑制作用。

HPLC法测定紫草中萘醌类成分

目的建立紫草中3种萘醌类成分的HPLC测定方法。方法采用流动相制备供试液;色谱柱为Kromasil100-5C18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5),流速为1.0 ml·min-1,检测波长为516 nm,柱温为室温。结果左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁分别在0.016～0.32、0.14～2.8、0.16～3.2μg范围内具良好线性关系,平均回收率为分别为102.57%、100.16%、97.99%;6批商品紫草饮片中3种萘醌类成分的含量波动较大。结论该方法简便易行,能同时测定紫草中3种萘醌类成分,可用于紫草的质量控制。

正交试验优化紫草油制备工艺

目的对紫草油制备工艺进行优化,控制其质量。方法以左旋紫草素含量、微生物限度检查结果为指标,采用L9（34）正交试验,考察加热温度、加热时间、浸泡时间三个因素的最优工艺。结果紫草油最优制备工艺为浸泡1 h、加热温度为140~150℃、加热60 min。结论在最优工艺下,紫草油的质量得到了控制。

HPLC法同时测定解毒生肌膏中6种成分

目的建立HPLC法同时测定解毒生肌膏（紫草、白芷、当归等）中6种成分的含有量。方法该药物甲醇提取液的分析采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;乙腈-0.5%冰醋酸为流动相,梯度洗脱;体积流量0.8 m L/min;柱温30℃;检测波长300 nm（欧前胡素、异欧前胡素）和516 nm（紫草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素）;进样量20μL。结果欧前胡素、异欧前胡素、紫草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素分别在2.74-54.80μg/m L（r=0.999 1）、1.90-38.00μg/m L（r=0.999 5）、2.12-42.40μg/m L（r=0.999 2）、8.48-169.60μg/m L（r=0.999 8）、4.92-98.40μg/m L（r=0.999 7）、4.66-93.20μg/m L（r=0.999 1）范围内线性关系良好,平均加样回收率（RSD）分别为99.72%（1.15%）、97.39%（1.49%）、98.29%（1.87%）、99.29%（1.94%）、98.51%（1.42%）、97.21%（1.55%）。结论该方法简便准确,专属性强,重复性好,可用于解毒生肌膏的质量控制。

乙酰紫草素注射液对小鼠Lewis肺癌生长抑制的研究

目的:探讨乙酰紫草素注射液对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用。方法:建立C57BL/6小鼠lewis肺癌模型进行体内抗瘤实验并计算抑瘤率。结果:乙酰紫草素注射液高中低剂量组的抑瘤率分别为55.49%,45.25%和28.09%。结论:乙酰紫草素注射液能明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长。

低共熔溶剂萃取高效液相色谱法测定紫草中的活性成分

建立了一种基于疏水性低共熔溶剂涡旋辅助分散液液微萃取法用于提取紫草中的乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素,并结合高效液相色谱法测定对目标分析物进行分离与测定。本研究以四丁基氯化铵为氢键受体,正辛酸为氢键供体,合成了一种新型疏水性低共熔溶剂作为萃取剂,其在涡旋辅助作用下分散于样品水溶液中,以增加萃取剂与目标分析物的接触面积,经离心后疏水性低共熔溶剂与样液实现相分离,吸取低共熔溶剂相经乙腈稀释后过滤,进行色谱分析。实验结果表明,在线性范围内各目标分析物具有良好的线性关系(R≥0.9999),其检出限和定量限的范围分别为0.31~0.49μg/L和1.03~1.64μg/L。日内精密度和日间精密度分别为0.33%~1.87%和0.87%~2.60%。本方法以疏水低共熔溶剂代替传统有机溶剂作为萃取剂,具有检出限低、萃取时间短、成本低、绿色环保等特点,可应用于紫草中活性成分的测定。

RP-HPLC法同时测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量

目的:建立同时测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Kromasil 100-5 C18,流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(80∶20,V/V),流速为1.0 m L/min,检测波长为516 nm,柱温为25℃,进样量为10μL。结果:紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素检测质量浓度线性范围分别为0.404~10.100μg/m L(r=0.999 8)、5.350~107.000μg/m L(r=0.999 6)、2.035~40.700μg/m L(r=0.999 8);定量限分别为0.40、2.91、1.34μg/m L,检测限分别为0.12、0.87、0.40μg/m L;精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2.0%(n=6);加样回收率分别为99.12%~104.18%(RSD=1.85%,n=6)、96.51%~100.21%(RSD=1.43%,n=6)、98.11%~102.51%(RSD=1.42%,n=6)。结论:该方法操作简便,精密度、稳定性、重复性好,可用于新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素含量的同时测定。

正交试验优选复方紫草油的制备工艺

目的优选复方紫草油的最佳制备工艺。方法以紫草素含量为指标,应用L8(27)正交试验设计对复方紫草油进行最佳制备工艺筛选。结果取软紫草加4倍花生油量,监测油温不超过150℃,提取1h可制备最佳复方紫草油。结论采用优选的制备工艺能有效提高复方紫草油中紫草素含量,稳定制剂质量。

乙酰紫草素对小鼠肝癌移植性肿瘤的抑制作用初步研究

目的:观察乙酰紫草素对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤作用。方法:采用小鼠肝癌H22模型进行体内抑瘤实验。观察荷瘤动物的生长情况,测量各实验组肿瘤体积及瘤质量变化,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。结果:乙酰紫草素低、中、高三个剂量组的抑瘤率分别为23.39%、26.61%、37.90%(P<0.05)。各实验组小鼠免疫器官未见明显抑制。结论:乙酰紫草素对小鼠肝癌H22具有一定的抑制作用。

HPLC测定滇紫草及其两个近缘种中乙酰紫草素的含量

目的建立滇紫草、密花滇紫草和昆明滇紫草中乙酰紫草素的含量测定方法。方法采用HPLC法测定滇紫草、密花滇紫草和昆明滇紫草中乙酰紫草素的含量。结果乙酰紫草素在0.0952~1.9030μg范围内呈良好的线性关系。精密度、稳定性、重复性和加样回收率均达到要求。结论该方法简便、准确、重现性好,可用于滇紫草及其两个近缘种中乙酰紫草素含量的测定。

HPLC法测定大鼠血浆及粪便中新疆紫草3种萘醌类色素的含量

目的 建立测定大鼠血浆及粪便中新疆紫草3种萘醌类成分含量的高效液相色谱法（HPLC法）。方法 采用COSMOIL C_（18）-AR-Ⅱ（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱,流动相A乙腈（A）-0.15%甲酸（B）（v/v）溶液,进行洗脱,流速1.0mL/min,检测波长275nm,柱温25℃,检测时间35min。结果 血浆中左旋紫草素在0.40-6.40μg、乙酰紫草素在25.0-600.0μg、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素在25.0-600.0μg范围内均与峰面积呈线性关系,左旋紫草素回收率为97.78%-100.1%、乙酰紫草素为100.1%-100.2%、β-β′-二甲基丙烯酰紫草素为97.78%-100.1%,日间、日内RSD均〈1.5%。粪便中各组分在10-400μg/mL范围内与峰面积呈线性关系,平均回收率分别为（78.2±2.5）%、（82.0±2.9）%和（79.5±3.5）%。0-12、12-24、24-48h粪便中左旋紫草素绝对回收量分别为23.61、38.28、4.13mg;乙酰紫草素分别为7.20、70.78、11.53mg;β-β′二甲基丙烯酰紫草素分别为46.32、60.15、16.88mg。结论 HPLC法准确可靠,重复性好,适用于测定血浆及粪便中新疆紫草萘醌类成分含量。

基于生物活性导向分离及灰色关联分析的新疆紫草抑菌物质基础研究

目的明确新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnstn.]发挥抑菌作用的主要有效成分。方法用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立新疆紫草不同极性溶剂提取物的指纹图谱,以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌为研究对象,考察新疆紫草不同极性溶剂提取物的抑菌作用,用灰色关联度分析法建立谱-效关系;用制备液相对新疆紫草中抑菌关联度较高的成分乙酰紫草素、紫草素进行敲除,制备相应的目标成分及其阴性样品,并分别进行抑菌实验。结果乙酰紫草素目标成分与提取物能明显抑制金黄色葡萄球菌,而目标成分阴性样品未表现出抑制作用。结论乙酰紫草素为新疆紫草抑制金黄色葡萄球菌的主要有效成分。

基于“辨色论质”的新疆紫草质量评价研究

目的:测量紫草的色泽,测定紫草中6个主要紫色素类成分(乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素)的含量,研究新疆紫草色泽与6个主要紫色素成分含量的相关性。方法:采用分光测色仪测定样品粉末的L、a、b值用于表征紫草的色泽。国际照明委员会(CIE)制定了Lab颜色模型,是人类视觉的数字化描述,L值越大表示亮度越大,a值增大表示偏红减小表示偏绿,b值增大表示偏黄减小表示偏蓝;采用高效液相色谱法(HPLC)测定紫色素类成分的含量,使用SPSS软件计算L、a、b值与6个主要紫色素含量的相关程度。结果:135批样品乙酰紫草素的含量为0.01%~3.39%,β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁含量为0.00%~1.95%,去氧紫草素含量为0.00%~0.23%,异丁酰紫草素含量为0.01%~1.13%,异戊酰紫草素含量为0.02%~2.88%,β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁含量为0.01%~2.17%。紫草药材的L(黑_白)色度值与乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁和异丁酰紫草素3个成分的含量呈显著负相关关系,斯皮尔曼相关系数在-0.138和-0.222之间;a(绿_红)色度值与β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰阿卡宁的含量均呈现显著的正相关,斯皮尔曼相关系数在0.176和0.355之间;b(蓝-黄)色度值与乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰阿卡宁均呈现显著的相关性,其中,与β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁呈正相关,系数为0.290,与其余4个成分呈负相关,系数在-0.325和-0.633之间。结论:建议紫草(新疆紫草)的含量测定项修订为β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁不得少于0.30%并且异丁酰紫草素不得少于0.29%。