志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系

目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。

鲍曼不动杆菌多重耐药与胞膜主动外排作用关系的研究

目的观察外排泵抑制剂对多重耐药不动杆菌耐药水平的降低作用,并扩增外排泵蛋白编码基因,以探讨不动杆菌多重耐药与细胞膜主动外排作用的关系。方法用琼脂稀释法测定30株鲍曼不动杆菌对环丙沙星、四环素、阿米卡星和亚胺培南的最小抑制浓度(MIC)值,并观察在含10μg/ml利血平或25μg/ml羰基氰氯苯腙(CCCP)条件下MIC值的变化。用PCR法扩增外排泵编码基因adeB。结果以环丙沙星、四环素、阿米卡星和亚胺培南作为底物,分别有12、5、6、6株菌在10μg/mlCCCP或含25μg/ml利血平的条件下MIC值降低4倍或4倍以上。6、11、17号菌都同时对3种药物有明显的外排作用。以利血平和CCCP作为抑制剂所得的结果一致。18株菌经PCR扩增得到与目的片段大小一致的阳性片段,经测序证实与GenBank登录号为AF370885的鲍曼不动杆菌RND族药物外排泵编码基因adeB的同源性达99%。该序列已在GenBank登录,登录号为DQ294294。结论主动外排作用是鲍曼不动杆菌多重耐药的重要原因之一。

铜绿假单胞菌中RND外排泵功能的研究

目的铜绿假单胞菌的耐药性与细胞膜的低通透性和膜上存在的RND外排泵有关,而且RND外排泵起主导作用。方法利用发光杆菌的荧光素酶基因操纵子luxCDABE为报道子,对铜绿假单胞菌基因组中所有的12种已知和可能的RND外排泵基因进行了系统的研究。结果低于抑制浓度庆大霉素对PAOC和PAOI有明显的调节作用。低于抑制浓度四环素对PAOJ调节作用,但属于同一类抗生素的土霉素却没有调节作用。α-氨苄青霉素对12个RND外排泵中的11个都有明显的调节。结论这些RND受不同类型抗生素调节并将它们向外排出。外排泵所向外排出的物质如抗生素,在结构上没有可识别的相关性。其中一个由基因PA2520,PA2521和PA2522组成的RND外排泵,不仅能够向外排出锌离子,而且还能向外排出抗生素。

细菌外排泵介导耐药性研究进展

随着抗生素的广泛应用,临床上产生一些多重耐药菌株。多重耐药菌株的产生使常规抗生素在临床细菌性感染治疗中失效。细菌主动外排是耐药菌株产生多重耐药的主要机制之一;因此有关细菌主动外排泵的研究也是近年来细菌多重耐药机制研究中,相对较新和活跃的领域。本文结合当前主动外排泵研究的进展,对主动外排蛋白的分类、组成和主要的主动外排系统的基因表达调控以及耐药性情况进行综述。

连翘对多药耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵编码基因adeB的影响

目的研究中药连翘对多药耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵编码基因adeB的影响,从分子水平探讨其主动外排耐药机制。方法从临床分离的30株多药耐药鲍曼不动杆菌中筛选出对环丙沙星(CIP)外排表型和外排泵编码基因均阳性的9株菌作为实验菌株,应用琼脂对倍稀释法检测连翘水煎剂作用前后CIP对上述9株菌的最小抑菌浓度(MIC),选取作用前后MIC变化较大的代表菌株进行基因测序,并将作用前后的测序结果进行比对分析。结果连翘水煎剂可降低CIP对多药耐药鲍曼不动杆菌的MIC;PCR扩增目的基因片段为2 242 bp,与预期结果一致;测序分析表明,连翘作用后鲍曼不动杆菌adeB基因序列共有12个碱基突变;突变发生氨基酸替换的有E140V、K145I、A147V、K150N、A151V、K153I,并有3个未发生氨基酸替换的突变。结论连翘水煎剂可抑制鲍曼不动杆菌的主动外排泵,并可引起主动外排泵编码基因adeB序列发生变异。

氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌norA基因表达的影响研究

目的研究氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌norA基因表达的影响。方法荧光测定法研究氟喹诺酮类药物在临床分离的金黄色葡萄球菌SAUz及其诱导耐药菌中的蓄积量及能量抑制剂羰氰氯苯腙(CCCP)对蓄积量的影响,应用狭线杂交法检测细菌norA基因转录水平。结果氟喹诺酮类药物在诱导耐药菌SAUz-16中的蓄积量明显低于其亲代株SAUz,加入CCCP后,亲水性氟喹诺酮类药物在SAUz-16菌体中蓄积量增加,但仍未达到亲代株的稳态水平,诱导耐药菌SAUz-16 norA基因转录水平高于其亲代菌SAUz。结论氟喹诺酮类药物可导致norA基因表达增加,norA基因表达增加导致的氟喹诺酮类药物泵出增加是药物在金黄色葡萄球菌菌体内蓄积量减少的原因之一。

金黄色葡萄球菌norA基因的研究

目的研究norA基因介导的金葡菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法PCR法制备DIG-norA基因探针;点杂交及狭线杂交检测细菌norA基因及其转录水平。结果所有实验菌株均检测到norA基因;诱导耐药菌SA2-16的norA基因转录水平明显高于其亲代株,临床分离耐药菌norA基因转录水平略高于敏感菌,但统计学分析无显著性差异,细菌在环丙沙星1/10MIC浓度中生长,未见norA基因转录增加。结论norA基因可能为金葡菌的结构基因,诱导耐药菌药物泵出增加的原因在于norA基因转录的增加,norA基因介导的耐药在不同的耐药菌株中所起的作用并不相同。

志贺菌主动外排泵调控基因marOR突变与泵表达水平的关系

目的了解临床分离志贺菌调控基因marOR的突变情况，并探讨其与主动外排泵表达水平的关系。方法对100株临床分离志贺菌和本实验室筛选的敏感菌及标准株的marOR基因进行聚合酶链反应（PCR），对扩增产物进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性（SSCP）分析，对marOR基因突变株进行测序，利用RT-PCR测定其泵基因acrA、acrB和tolC的表达水平，并对其进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明等6种药物的药敏试验。结果100株临床分离志贺菌、敏感株及标准株均扩增出marOR基因，未发现该基因缺失株；SSCP分析发现marOR基因的突变率为23％；随机选择11株marOR基因突变株和1株敏感株及标准株进行测序，其中有9株存在4个碱基的缺失和3个位点的碱基突变，RT-PCR分析表明11株marOR基因突变株的acrAB—tolC主动外排泵表达水平高于敏感株和标准株，且该11株均为多重耐药株。结论在该实验中志贺菌marOR基因突变率较高，其突变株的acrAB—tolC主动外排泵基因高表达，可能增加耐多药性。

某院4株携带Ⅰ类整合酶基因的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制研究

目的分析该院4株不同耐药程度的Ⅰ类整合酶基因(IntⅠ)阳性铜绿假单胞菌(PA)的相关耐药机制,从而进一步研究不同耐药机制之间的相互作用。方法采用qPCR检测头孢他啶(CAZ)、亚胺培南(IMP)诱导下的4株PA的IntⅠmRNA的相对表达水平;采用PCR检测4株PA的β-内酰胺酶(blaTEM、blaNDM-1、blaVIM、blaIMP)、主动外排系统(MexAB-OprM)、外膜蛋白(OprD2)的表达水平,并采用qPCR检测4株PA的OprM、OprD2的表达水平;采用1%结晶紫染色检测4株PA的生物膜形成能力。结果编号为PA01、PA02、PA04的菌株在CAZ、IMP诱导下,IntⅠmRNA的相对表达水平均较对照组高(P<0.05),PA01、PA02的IntⅠmRNA的相对表达水平高于PA04,组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05),并且在一定浓度范围内,IntⅠmRNA的相对表达水平随着抗菌药物的浓度增加而增加。但PA03菌株的IntⅠmRNA的相对表达水平较PA01、PA02、PA04低,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。PA01、PA02检测到blaTEM,而blaNDM-1、blaVIM和blaIMP均未被检测到;PA01、PA02的外排泵相对表达水平高于PA03、PA04(P<0.05);PA01、PA02的OprD2 mRNA的相对表达水平低于PA03、PA04(P<0.05);PA01、PA02的生物膜形成能力弱于PA03、PA04,且PA03菌株的生物膜形成能力最强。结论PA01、PA02、PA04的IntⅠ在抗菌药物的选择性压力下表达增强,并且PA01、PA02对碳青霉烯类耐药主要由IntⅠ高表达、外排泵过表达及膜通透性降低介导,与β-内酰胺酶及生物膜形成关系不大。

外排泵adeFGH基因与鲍氏不动杆菌多药耐药的关系研究

目的探讨临床分离鲍氏不动杆菌主动外排基因adeFGH的表达与其多药耐药的关系。方法对2012年1-2月临床分离的60株鲍氏不动杆菌进行回顾性分析,采用BD CRYSTAL细菌鉴定系统进行细菌检测,采用法国生物梅里埃公司ATB药敏系统进行药物敏感试验,PCR检测外排泵基因adeFGH的分布和表达水平。结果痰液及伤口分泌物中分别检出鲍氏不动杆菌51及8株,分别占85.0%、13.3%;科室分布主要为ICU、神经外科、呼吸内科、烧伤科,分别占43.3%、28.3%、10.0%、10.0%;60株鲍氏不动杆菌按药敏结果分为A组全耐药共31株,B组为氨基糖苷类和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶敏感、其他抗菌药物耐药共13株,C组为耐阿莫西林和一、二代头孢菌素类抗菌药物、其他抗菌药物敏感,共16株;A组均检出外排泵基因adeFGH,B组均检出外排泵基因adeFGH,C组检出外排泵基因adeG16株、adeH3株,未检出adeF。结论外排泵基因adeFGH与鲍氏不动杆菌对氨基糖苷类和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药无关,外排泵基因adeG与鲍氏不动杆菌对青霉素类和一、二代头孢菌素类抗菌药物耐药有关。

AcrAB-TolC主动外排系统与猪源耐药大肠杆菌多重耐药的相关性

以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。