利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts, PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。

ACTA2基因在人肿瘤中致癌作用的泛癌分析

目的:研究ACTA2基因在人肿瘤组织的表达、预后相关性、基因变异和免疫浸润等情况,进而探究其临床意义。方法:使用TIMER2.0、GEPIA2、HPA数据库及仙桃学术网站,分析各种类型肿瘤组织中ACTA2的表达情况及其与预后的相关性。使用cBioPortal数据库分析ACTA2基因变异情况。使用TIME2.0分析ACTA2在肿瘤中的免疫浸润水平。使用STRING、GEPIA2、Veen网站和R包进行ACTA2相关基因的富集分析。结果:胶质细胞瘤、肝癌、胰腺腺癌等肿瘤组织中,ACTA2高表达与预后不良相关;子宫内膜癌组织中ACTA2低表达与预后不良相关(均P<0.05)。ACTA2最主要的变异类型是拷贝数缺失。ACTA2的表达与多形成性胶质细胞瘤及肺腺癌等的肿瘤相关成纤维细胞浸润水平呈正相关(均P<0.05)。ACTA2相关基因的富集分析显示,肌动蛋白细胞骨架调节、血管平滑肌收缩参与了ACTA2的功能机制。结论:ACTA2表达与临床预后、基因变异及免疫浸润水平相关,ACTA2可能作为多种肿瘤新的生物标记物。

糖尿病患者并发肛周脓肿的临床特点及与HbA1C、WBC、ACTA、MMP⁃2的相关性

目的分析糖尿病(DM)患者并发肛周脓肿的临床特点及与糖化血红蛋白A1C(HbA1C)、白细胞计数(WBC)、激活素A(ACTA)、基质金属蛋白酶⁃2(MMP⁃2)的相关性。方法选取2019年2月至2022年5月期间邢台市第五医院收治的100例DM患者,根据患者是否并发肛周脓肿分为并发组(n=22)和非并发组(n=78),分析DM患者并发肛周脓肿的病原菌检出情况,比较两组患者基线资料及血清HbA1C、WBC、ACTA、MMP⁃2水平,分析糖尿病并发肛周脓肿与上述血清指标的相关性。结果42份样本中有36份检测出细菌,其阳性率为85.71%;36份标本中检测出38株细菌,34份为单一感染,2份为混合感染;38株细菌中有26株革兰氏阴性菌,以大肠埃希菌(36.84%)、肺炎克雷伯菌(18.42%)为主;10株革兰氏阳性菌,以金黄色葡萄球菌(15.79%)为主;2株真菌为白假丝酵母(5.26%);并发组血清HbA1C、WBC、ACTA、MMP⁃2水平均高于非并发组,差异有统计学意义(t=2.192、16.018、9.134、6.105,P<0.05);经Pearson相关性分析结果显示,DM合并肛周脓肿与HbA1C、WBC、ACTA、MMP⁃2呈正相关(r=0.563、0.472、0.785、0.681,P<0.05)。结论合理使用抗生素控制感染,密切监测血清HbA1C、WBC、ACTA、MMP⁃2水平可作为预防、治疗DM并发肛周脓肿的依据。

血清ACTA、HSP70、PTX-3水平变化与ARDS患者疾病转归的关系

目的:探讨血清激活素A(ACTA)、热休克蛋白70(HSP70)、正五聚蛋白-3(PTX-3)水平变化与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者疾病转归的关系.方法:选取2021年4月-2023年4月我院收治的135例ARDS患者为研究对象,根据28d后疾病转归情况将患者分为病死组(57例)和存活组(78例).比较两组动脉血二氧化碳分压(PaCO_(2))、氧合指数(PaO_(2)/FiO_(2))、急性生理学及慢性健康状况评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、序贯性器官衰竭评分(SOFA),比较两组入院时血清ACTA、HSP70、PTX-3水平,分析相关性及ARDS患者病死的危险因素,ROC分析联合预测价值.结果:病死组PaO_(2)/FiO_(2)水平高于存活组,APACHE Ⅱ评分、SOFA评分低于存活组(P<0.05);入院时病死组血清ACTA、HSP70、PTX3水平高于存活组血清水平(P<0.05);入院时血清ACTA、HSP70、PTX3水平与PaO_(2)/FiO_(2)呈负相关,与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分呈正相关(P<0.05);Logistic回归分析显示,APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、血清ACTA、HSP70、PTX3水平、PaO_(2)/FiO_(2)为ARDS患者病死的影响因素(P<0.05);入院时血清ACTA、HSP70、PTX3水平联合预测ARDS患者病死的AUC大于各单项指标(P<0.05).结论:血清ACTA、HSP70、PTX-3水平变化与ARDS患者病情严重程度及疾病转归关系密切相关,可作为临床诊断、评估预后的参考依据.

产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程。[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价。[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失。突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约103倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击。实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力。[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

利用PCR技术从血清型1／2a的产单核细胞李斯特菌Lm-4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA，转入E．coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa。以纯化蛋白为材料进行了AetA单抗的研制，获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1：5×10^4-1：1×10^5。选取单抗1A5进行Western blot分析，结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异性反应，且与Lm-4多抗血清的Western blot结果一致。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础。

单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlB/actA双缺失突变株的构建

单核细胞增生李斯特菌inlB和actA毒力基因的编码产物InlB和ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而内化素InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因inlB和actA双缺失的突变株,获得减毒突变株,为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。

血清H-FABP、ACTA、ADT、BNP及血管紧张素与心力衰竭的关系

目的:研究血清H-FABP、ACTA、ADT、BNP及血管紧张素与心力衰竭的关系。方法:选取于本院进行诊治的84例心力衰竭患者为观察组,并选取同时期的84名体检健康的同龄人为对照组,然后将两组的血清H-FABP、ACTA、ADT、BNP及血管紧张素水平进行比较,同时比较观察组中不同NYHA分级心力衰竭患者的血清检测水平,并采用Logistic分析处理上述血清指标与心力衰竭的关系。结果:观察组的血清H-FABP、ACTA、ADT、BNP及血管紧张素水平均高于对照组,同时观察组中较高NYHA分级心力衰竭患者的血清检测水平高于较低NYHA分级的患者,且经Logistic分析显示上述血清指标均与心力衰竭有密切的关系,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:血清H-FABP、ACTA、ADT、BNP及血管紧张素与心力衰竭有密切的关系,可作为心力衰竭患者诊治的重要监测指标。

延边黄牛ACTA1基因的SNPs检测及其与肉质性状的关联分析

试验旨在研究延边黄牛ACTA1基因的遗传变异,分析其多态性对肉质性状的影响。采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法探讨ACTA1基因多态性及其与肉质性状的关联性。结果发现,延边黄牛ACTA1基因存在2个突变位点:A193G突变,导致氨基酸Arg→Gly的错义突变;A298G突变,导致氨基酸Lys→Arg的错义突变。χ2检验显示,A193G和A298G位点于检测群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。关联分析显示,延边黄牛ACTA1基因2个突变位点的不同基因型与肌肉中肉豆蔻酸、油酸含量、眼肌面积、大理石花纹等级呈显著相关(P<0.05)。初步认为ACTA1基因对延边黄牛肉质性状有显著影响,可作为延边黄牛新品种早期选择的候选基因。

猪ACTA2基因的克隆、表达分析及其与生产性状的关联

为鉴定对猪生产性状有重要影响的新分子标记,文章采用电子克隆结合PCR方法获得了猪肌动蛋白α2(Actin alpha 2,ACTA2)基因编码区序列和部分基因组序列,建立了第2内含子C1554T替换的PCR-HinfⅠ-RFLP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中除大白和梅大群体外,其他群体中均是C等位基因频率高于T等位基因的频率。标记与性状关联分析发现ACTA2基因型与肩部背膘厚、臀部背膘厚、肥肉率、瘦肉率、股二头肌pH和肌内脂肪显著或极显著相关,TT基因型与CC基因型相比具有更高的瘦肉率以及更低的肥肉率和背膘厚。通过Real-time RT-PCR分析发现ACTA2在大白和梅山两个品种猪骨骼肌中的表达量都随着日龄的增加而降低,在各个阶段,梅山猪中的表达量都比大白猪中的表达量高。

脑缺血损伤ActA与跨膜受体ActRIIA在Smads转导通路中的表达

目的探讨脑缺血损伤ActA/Smads通路主要位点基因表达在信号转导中的作用及其机制。方法建立PC12细胞神经元氧糖剥夺(OGD)体外脑缺血模型,应用Real-time PCR技术,检测OGD3h、6h、9h、12h、16h、24h ActA及其受体ActRIIA和下游Smad3mRNA表达变化。结果 OGD3h PC12细胞ActβA、ActRIIA及Smad3 mR-NA表达均显著升高且达高峰;OGD6h ActβA mRNA表达有所降低并呈逐渐下降趋势;OGD6h ActRIIA表达开始下降,但其下降趋势弱于ActβA,在OGD9h仍高于正常对照组,OGD24h达最低点;OGD6hSmad3 mRNA表达也开始下降,但其下降趋势弱于ActRIIA,在OGD16h仍高于正常对照组,OGD24h达最低点(组间比较P<0.05)。结论ActA/Smads通路的活性随OGD时间呈动态变化,短时程OGD可能通过诱导神经元跨膜受体ActRIIA的上调激活该信号转导通路。

单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性研究及单克隆抗体的制备

原核表达单增李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,检测ActA的免疫原性,以表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,并对单抗的亚型、效价、亲合力及特异性进行测定。结果表明,成功表达了ActA蛋白;表达蛋白诱导了特异性的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫原性;共获得4株抗Lm ActA单克隆抗体。其中3G6、4E10和2B9为IgG1亚类;腹水抗体效价,3G6和4E10为1∶64000,2B9为1∶32000;3G6、4E10和2B9的亲和常数分别为6.62×107M-1、5.67×107M-1和7.15×106M-1;3G6、2B4和4E10为Lm特异性单抗,2B9为致病性李斯特菌特异性单抗。所制备的单抗可用于Lm检测方法的建立。

GFP用于单核细胞增生李斯特菌PrfA调控毒力基因actA转录表达的研究

PrfA是单核细胞增生李斯特菌(LM)中迄今为止发现的惟一个调控绝大多数毒力基因转录表达的蛋白因子。为了研究PrfA转录调控毒力基因表达的分子机制,将无启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因与毒力基因actA的启动子融合,连接到穿梭载体pLSV16质粒上,构建成表达融合载体pLSV16-PactA-gfp,然后将其电转化入LM野生株P14、PrfA高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中表达。利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测上述3株细菌中绿色荧光蛋白的不同表达强度,从而评价actA基因依赖于PrfA的转录活性强弱。结果显示,绿色荧光蛋白在P14a中发出的荧光强度最高,P14次之,A42最弱,两两比较均有显著差异(P<0.01),表明毒力基因actA的转录水平高低与PrfA的活性成正相关,其转录表达依赖于PrfA的调控;该试验同时也显示GFP能方便、有效地用于研究PrfA调控LM不同毒力基因的转录表达水平。

论我国知识产权的刑事法律保护——以TRIPS协议与ACTA为视域

在我国加入世界贸易组织(WTO)十周年之际,本文以TRIPS协议为视域对我国知识产权刑事法律保护加以回顾并认为:我国对所承诺TRIPS协议中知识产权的刑事法律保护义务通过国内法得到了切实落实,个别规定还高出了国际公约。随着知识经济的逐渐发展,无论中国的主观意愿如何,越来越高标准的国际知识产权保护体系必将中国裹挟其中,对中国经济贸易的发展产生巨大影响。中国今后能否达到知识产权保护国际标准、这种国际标准是否符合中国国情无疑给中国知识产权刑事保护带来隐忧,而政府对知识产权保护的积极态度及其强有力的国家力量、法学界对中国知识产权刑事保护的积极探索与研究则是中国知识产权刑事保护的希望所在。本文提出我国知识产权刑事立法应采取分散型模式、立法内容应以达到国际公约基本要求的适度保护为准、应对相关出口企业普及相关国际公约知识以免受制裁。

真武汤对转基因扩张型心肌病小鼠心肌Acta1、Col3a1基因及蛋白表达的影响

目的:本研究旨在观察转基因扩张型心肌病小鼠心肌组织Acta1、Col3a1基因及蛋白表达变化,探究真武汤防治扩张型心肌病的分子生物学机制。方法:将cT nT R141W基因转入C57BL/6J小鼠,建立了心肌组织特异表达cT nT R141W基因的转基因小鼠模型,以C57BL/6J小鼠15只作为空白对照组,模型组小鼠60只,随机分为模型对照组、西药组、中药高剂量组及中药中剂量组,中药组以真武汤高中剂量对模型小鼠治疗4周,卡托普利为阳性对照药物。4周后采用qRT-PCR法检测各组心肌组织Acta1、Col3a1相对表达量; Western Blot法检测各组心肌组织Acta1、Col3a1蛋白表达。结果:与空白对照组比较模型对照组Acta1、Col3a1基因及蛋白表达显著升高(P <0. 01),与模型对照组比较西药组及中药高中剂量组Acta1、Col3a1基因及蛋白表达均显著下降(P <0. 01)。结论:DCM的发病机制与心肌组织中Acta1与Col3a1mRNA及蛋白表达升高有关,真武汤通过下调心肌组织中Acta1与Col3a1 mRNA及蛋白表达,抑制心肌细胞肥大及纤维化过程,起到防治DCM的作用。

单核细胞增生李斯特菌ActA单克隆抗体的制备

原核表达单核细胞增生李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,以Lm全菌为免疫原、以纯化的表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,共获得4株抗Lm ActA单克隆抗体。其中3G6、4E10和2B9为IgG1亚类,2B4为IgM亚类;检测腹水抗体效价,3G6和4E10为1∶64 000,2B9为1∶32 000;3G6、4E10和2B9的亲和常数分别为6.62×107L/mol、5.67×107L/mol和7.15×106L/mol;3G6、2B4和4E10为Lm ActA特异性单抗,2B9为致病性李斯特菌特异性单抗。所制备的单抗为Lm检测方法的建立奠定了基础。

ACTA的“变相”回归及中国对策研究

2012年7月4日,ACTA在欧盟批准程序的失败宣告着ACTA文本的落幕,正当国际社会松下一口气的时候,美国主导的TPP、TTIP谈判进入人们的视野,其文本草案无一不在昭示着ACTA"变相"回归的趋势。中国作为世界第二大经济体国家将深受其害,不论是经济、政治还是文化都将受到一定程度的影响。对此,中国应持续关注谈判进展,从政府、企业和学者层面积极寻求科学、合理的应对之策,以此减轻、化解TPP、TTIP协议可能带来的冲击。

知识产权执法的国际新标准以及我国的应对——以ACTA民事救济措施为例

ACTA作为知识产权执法的最新国际标准,在个别侵权救济措施方面超越了TRIPs协议的要求。但是,我国现行知识产权法与ACTA之间并不存在深刻的矛盾,甚至在大多数方面已经符合ACTA的标准。因此,是否接受ACTA规则可以作为我国政府在知识产权国际谈判中的筹码。同时,ACTA提供了一个全面审视、评估、反思和构建我国知识产权执法制度的机会。

HIE患儿血清tau蛋白、ACTA及尿酸表达与其病情、神经发育预后的关系

目的研究新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿血清tau蛋白、外源性激活素A(ACTA)及尿酸(UA)表达与其病情、神经发育预后的关系。方法收集2017年2月~2019年12月于我院诊治的108例HIE患儿为研究组,另选取同期健康的新生儿98例作为对照组。比较两组tau蛋白、ACTA及UA水平;对比不同病情、不同神经发育预后[采用格赛尔发育量表(Gesell)评估]HIE患儿tau蛋白、ACTA及UA水平,绘制ROC曲线分析上述因子水平对HIE患儿神经发育预后不良的预测价值。结果研究组tau蛋白、ACTA及UA水平较对照组高(P<0.05);不同病情HIE患儿tau蛋白、ACTA及UA水平比较:重度>中度>轻度(P>0.05);108例HIE患儿中,神经发育预后良好84例(77.78%),神经发育预后不良24例(22.22%),神经发育预后良好组tau蛋白、ACTA及UA水平明显低于神经发育预后不良组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示:tau蛋白、ACTA及UA水平对HIE患儿神经发育预后不良具有高预测价值,其中以联合检测的曲线下面积最大,为0.745;单项检测中以tau蛋白的曲线下面积最大,为0.658。结论HIE患儿血清tau蛋白、ACTA及UA呈高表达,可能与HIE患儿病情、神经发育预后密切相关,检测上述因子水平有助于评估患儿神经发育预后。