仙茅苷介导PERK/ATF4/CHOP通路减轻UC大鼠肠黏膜病理改变的作用与机制探讨

目的 观察仙茅苷治疗溃疡性结肠炎(UC)大鼠的作用,并探讨其对蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的调控作用。方法 取61只SD大鼠以三硝基苯磺酸(TNBS)法诱导建立UC模型,按随机数字表分为仙茅苷低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg仙茅苷溶于生理盐水),美沙拉嗪组(500 mg/kg美沙拉嗪溶于生理盐水)、PERK抑制剂组(GSK2606414 1.0 mg/kg溶于生理盐水)、模型组(生理盐水),另取10只健康SD大鼠记为正常组(生理盐水),生理盐水体积均为1 ml/100 g大鼠体质量,均灌胃每天1次,连续10 d。给药结束后次日,评价疾病活动指数(DAI);气相色谱法(GC)测定两组大鼠5 h尿液中乳果糖(L)与甘露醇(M)排泄率(L/M)比值;双抗体夹心法测定血清糖皮质激素浓度,酶联免疫法测定血清白介素-6(IL-6)、干扰素(IFN-γ)、白介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肠黏膜病理改变;实时-逆转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肠黏膜组织PERK、ATF4、CHOP、Bcl2关联X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫印迹法(WB)检测肠黏膜组织PERK、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达及磷酸化PERK(p-PERK)水平。结果 肉眼和HE染色观察证实建模成功;与正常组比较,模型组L/M,DAI和肠黏膜病理评分,血清糖皮质激素浓度和血清IL-6、IFN-γ、IL-8和TNF-α水平,PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA与蛋白表达,p-PERK水平均升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达均下降(P<0.05);与模型组比较,仙茅苷3个剂量组、美沙拉嗪组、PERK抑制剂组L/M,DAI和肠黏膜病理评分,血清糖皮质激素浓度和血清IL-6、IFN-γIL-8和TNF-α水平,PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA与蛋白表达,p-PERK水平均下降(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);糖皮质激素浓度、PERK、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达,p-PERK水平仙茅苷低剂量组与美沙拉嗪组,仙茅苷中剂量组与美沙拉嗪组、PERK抑制剂组其它指标差异均无统计学意义(P>0.05),其余每2组比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组结肠黏膜病理严重改变,仙茅苷低剂量组有所减轻,仙茅苷中剂量组、美沙拉嗪组和PERK抑制剂组均明显减轻,仙茅苷高剂量组显著减轻。结论 仙茅苷可改善UC大鼠肠黏膜屏障功能、控制疾病活动度、减轻病理改变,推测与抑制PERK/ATF4/CHOP通路有关。

加味脑泰方对去势脑缺血大鼠海马ATF4/CHOP/Puma通路的影响

目的:研究加味脑泰方对去卵巢脑缺血大鼠海马活化转录因子4 (ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)/p53上调凋亡调控因子(Puma)通路的影响。方法:将雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、加味脑泰方组和阳性对照组,除假手术组外,其它大鼠均行去卵巢术;术后11 d,阳性对照组和加味脑泰方组给予相应药物灌胃,连续灌胃3 d后行脑缺血术。术后24 h进行行为学评价,取海马组织行RT-qPCR检测Bax、Bcl-2和caspase-3的mRNA表达,Western blot检测各组大鼠海马组织中Bax、Bcl-2、caspase-3、ATF4、CHOP和Puma蛋白表达。结果:与假手术组比较,各组的海马神经功能评分明显增高;与模型组比较,加味脑泰方组与阳性对照组的神经功能评分明显降低(P <0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠海马Bax、caspase-3、ATF4、CHOP和Puma的蛋白表达及Bax和caspase-3的mRNA表达明显升高,而Bcl-2的mRNA和蛋白表达明显降低(P <0.05);与模型组比较,加味脑泰方明显降低Bax、caspase-3、ATF4、CHOP和Puma表达,提高Bcl-2表达(P <0.05)。结论:加味脑泰方可能通过抑制ATF4/CHOP/Puma通路相关mRNA及蛋白的表达而减轻脑缺血损伤。

前列地尔对暴发性肝衰竭大鼠eIF2α/ATF4/CHOP通路及肝功能的影响

目的探究前列地尔(PGE1)对暴发性肝衰竭(FHF)大鼠对肝功能的影响,并探讨其对真核翻译起始因子2α(eIF2α)/激活转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)通路的调控作用。方法SPF级SD雄性大鼠90只按随机数表法分为对照组、模型组、阳性对照组、低、中、高剂量PGE1组,除对照组外,其它组大鼠均采用腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)-大肠杆菌内毒素脂多糖(LPS)的方法建立FHF大鼠模型,对照组腹腔注射等量的生理盐水。造模6 h后,阳性对照组及低、中、高剂量PGE1组分别尾静脉注射促肝细胞生长素1.36 mg/kg,PGE112.5、25、37.5μg/kg,每天1次,连续给药3 d,对照组和模型组尾静脉注射等量的生理盐水。在造模72 h后处死大鼠,腹主动脉采血,检测血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平;解剖取肝组织用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组大鼠肝组织病理学变化;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肝组织中eIF2α/ATF4/CHOP/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA和蛋白、磷酸化-eIF2α(p-eIF2α)蛋白水平。结果与对照组相比,模型组肝细胞广泛变性并有局灶性坏死,中央静脉受损,血清ALT、AST、TBIL,肝组织中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平均升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、低、中、高剂量PGE1组肝细胞损害有所降低,坏死细胞数量减少,血清ALT、AST、TBIL水平,肝组织中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05);且随着PGE1给药剂量的增加,低、中、高剂量PGE1组血清ALT、AST、TBIL水平,肝组织中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平依次降低(P<0.05),呈剂量依赖性;与阳性对照组相比,低、中剂量PGE1组血清ALT、AST、TBIL水平,肝组织中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平均升高(P<0.05),高剂量PGE1组血清ALT、AST、TBIL水平,肝组织中eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA及p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论PGE1可能通过抑制eIF2α/ATF4/CHOP通路表达,减轻大鼠肝细胞凋亡,达到保护肝的作用,可能作为FHF潜在的治疗药物。

新麦纤散对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织ATF-4/CHOP表达的影响

目的:观察新麦纤散对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)大鼠结肠组织活化转录因子-4(Activating transcription factor-4,ATF-4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达的影响,探究其治疗UC的作用机制。方法:将60只SD大鼠随机分成正常组、模型组、美沙拉嗪组、新麦纤散低、中、高剂量组,每组10只,5%DSS用以诱导UC模型。美沙拉嗪组灌胃美沙拉嗪缓释颗粒混悬液0.42 g/(kg·d),新麦纤散低、中、高剂量组分别灌胃新麦纤散混悬液1.5、3、6 g/(kg·d),其余组大鼠予等体积生理盐水灌胃,连续治疗2周。观察大鼠一般情况,评估病理组织学损伤,采用Western Blot和RT-PCR法分别检测结肠组织ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠结肠病理损伤评分显著升高,结肠组织ATF-4、CHOP蛋白和mRNA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,美沙拉嗪组、新麦纤散低、中、高剂量组大鼠结肠病理损伤评分显著降低,结肠组织ATF-4、CHOP mRNA表达减少;美沙拉嗪组和新麦纤散中、高剂量组ATF-4、CHOP蛋白表达减少;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:新麦纤散对UC大鼠有较好的疗效,抑制结肠组织ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表达,减少细胞凋亡可能是其作用机制之一。

基于PERK/ATF4/CHOP的益肾通络方抑制内质网应激改善肾小管上皮细胞凋亡的作用机制

目的:验证益肾通络方(YSTLP)对肾小管上皮细胞凋亡的影响,并基于内质网应激通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)探讨其作用机制。方法:将db/db小鼠随机分为模型组、缬沙坦组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))、YSTLP低、中、高剂量组(1、2.5、5 g·kg^(-1)·d^(-1))给予药物干预8周后取材。同窝的db/m小鼠作为正常组。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常组、糖基化终产物(AGEs)组、AGEs+益肾通络方低、中、高质量浓度组(100、200、400 mg·L^(-1));原位末端标记(TUNEL)染色检测HK-2细胞的凋亡情况;细胞活力测定实验检测HK-2细胞存活率;钙离子荧光探针染色,以及荧光素酶报告基因法检测为折叠蛋白反应元件(UPRE)荧光素酶活力,检测内质网应激情况;免疫组化法(IHC)检测小鼠肾脏中磷酸化(p)-PERK蛋白的表达(p-PERK)、CHOP、ATF4的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中CHOP、X盒结合蛋白1(XBP1)的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中p-PERK、PERK、CHOP、ATF4、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、切割型胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)的蛋白表达水平。结果:细胞实验中,与正常组比较,AGEs组HK-2细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P<0.01),凋亡相关因子Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bax的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01),cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与AGEs组比较,YSTLP给药处理后,细胞活力提升,凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著升高(P<0.01),Bax的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低,cleaved Caspase-3的蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低(P<0.01)。与正常组比较,AGEs组细胞内Ca2+失衡,UPRE荧光素酶荧光强度增加(P<0.01),内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平显著升高(P<0.01),p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平明显提高(P<0.05);与AGEs组比较,YSTLP可有效改善HK-2细胞内Ca2+失衡,剂量依赖性降低UPRE荧光强度(P<0.01),降低内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平(P<0.01),剂量、时间依赖性降低细胞内p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)。动物实验中,与正常组比较,模型组小鼠Bcl-2的蛋白表达水平显著降低(P<0.01),cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,YSTLP组Bcl-2的蛋白表达水平呈剂量依赖性提升,cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组小鼠CHOP、XBP1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平明显提高(P<0.05);与模型组比较,YSTLP可显著降低CHOP、XBP1的mRNA表达水平(P<0.01),降低p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)。结论:YSTLP可有效抑制内质网应激、改善肾小管上皮细胞凋亡情况,其作用机制可能与调节PERK/AFT4/CHOP通路有关。

基于PERK/ATF4/CHOP途径探讨当归补血汤含药血清抑制糖尿病肾病内质网应激改善足细胞凋亡的机制

目的:观察当归补血汤对高糖刺激小鼠永生化足细胞MPC5内质网应激通路蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、切割型胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)的影响,通过体外研究阐明当归补血汤调控糖尿病肾病(DKD)足细胞凋亡的具体机制及靶点。方法:制备好含药血清、筛选好最适干预浓度后,将小鼠永生化足细胞MPC5分为5组:正常组(NG)、高糖组(HG)、空白血清组(KB)、当归补血汤含药血清组(DBT)、ERS抑制剂组(4-PBA)。NG组中足细胞用含5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖的完全培养基培养;HG组中足细胞用含30 mmol·L^(-1)葡萄糖的完全培养基培养;KB组即HG组+10%空白血清;DBT组即HG组+10%当归补血汤含药血清;4-PBA组即HG组+4-PBA(2.5 mmol·L^(-1))。各组予对应药物进行干预刺激,作用48 h,然后将细胞收集。原位末端标记法(TUNEL)测细胞DNA损伤,免疫荧光检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化(p)-PERK、ATF4、CHOP、足细胞膜蛋白(Podocin)、突触足蛋白(Synaptopodin)表达,同时提取足细胞蛋白,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GRP78、PERK、p-PERK、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达。结果:与正常组比较,高糖组GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP荧光强度显著增加,Podocin、Synaptopodin荧光强度减弱,足细胞TUNEL荧光阳性细胞核明显增多,GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著上升,Bcl-2表达显著下降(P<0.01)。与高糖组比较,当归补血汤含药血清组及ERS抑制剂组GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP的荧光强度明显减弱,Podocin、Synaptopodin荧光表达增强,TUNEL阳性染色细胞核的数量明显减少,细胞核损伤减轻,GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著下调,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01)。高糖组和空白血清组以上结果比较差异无统计学意义。结论:当归补血汤含药血清可通过拮抗PERK/ATF4/CHOP信号通路的活化实现对足细胞凋亡的抑制,保护足细胞。

冠状动脉介入围术期强化阿托伐他汀干预的临床效果分析

目的:为了探讨在急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者PCI围术期强化阿托伐他汀干预对ACS患者血清活化转录因子4(activated transcription factor 4,ATF-4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)水平的影响。方法:选取2021年10月至2023年6月在益阳市中心医院行择期PCI术的老年ACS患者168例,随机分成研究组和对照组,每组各84例。分别于治疗前、术后24h、术后48h、术后72h检测患者血清ATF-4、CHOP蛋白SCr、胱抑素C(Cystatin C,Cys C)水平;于治疗前和术后24h内检测CK-MB、cTnI水平,随访术后72h内ACS患者造影剂诱导急性肾损伤(contrast-induced acute renal injury,CI-AKI)情况,并比较CI-AKI组和非CI-AKI组血清ATF-4、CHOP蛋白水平差异。结果:在术后24h、术后48 h和术后72 h时,研究组血清ATF-4、CHOP蛋白水平均明显低于对照组(均P<0.05);术后24h时,研究组血清CK-MB、cTnI峰值均明显低于对照组(均P<0.05);在术后48h和72h时,研究组SCr和Cys-C水平均明显低于对照组(均P<0.05)。在使用对比剂72h内对照组与研究组CI-AKI发生率分别为16例(19.1%)和4例(4.8%),研究组患者CI-AKI发生率低于对照组(χ^(2)=8.173,P=0.004);在术后24h、术后48 h和术后72 h时,CI-AKI组ATF-4、CHOP蛋白水平均高于非CI-AKI组(均P<0.05)。并且CIAKI组患者术后72h内,血清ATF-4水平和CHOP水平一直呈上升趋势,而在术后72h时,非CIAKI组患者血清ATF-4水平较术后48h时有回落趋势。结论:ATF-4/CHOP是CI-AKI发生的重要分子机制,在PCI术前对ACS患者给予负荷剂量阿托伐他汀有助于降低血清ATF-4、CHOP水平,改善心功能和肾损伤,降低CI-AKI的发生率。

体外氧糖剥夺培养条件促进人牙髓细胞内质网应激的研究

目的通过氧糖剥夺(oxygen⁃glucose deprivation,OGD)体外模拟细胞缺血缺氧,观察人牙髓细胞(hu⁃man dental pulp cells,hDPCs)内质网应激变化,为缺血缺氧条件调控hDPCs的机制研究提供依据。方法应用无糖DMEM培养液联合低氧培养(体积分数2%O2)构建hDPCs OGD模型,体外模拟hDPCs缺血缺氧,设置对照组和实验组。对照组:常规培养;实验组:OGD处理0、2、4、8 h。MTT检测hDPCs OGD处理0、2、4、8 h后细胞存活率;qRT⁃PCR检测hDPCs内质网应激关键分子:剪切X盒结合蛋白1(splicing x⁃box binding protein 1,sXBP1)、活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,chop)mRNA水平,Western blot检测内质网应激关键蛋白:磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(phosphorylated RNA⁃activated protein kinase⁃like ER⁃resident kinase,p⁃perk)、磷酸化真核起始因子⁃2α(phosphorylated eukaryotic initia⁃tion factor⁃2α,p⁃eIF2α)表达水平。结果相较于OGD处理0 h,OGD培养hDPCs 2、4、8 h后,死亡细胞增多,细胞存活率显著下降(P<0.05)。与对照组相比,OGD处理4 h后,hDPCs内质网应激关键信号分子sXBP1、ATF4、CHOP mRNA表达水平升高;内质网应激关键蛋白p⁃perk、p⁃eIF2α表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论hDPCs OGD培养条件下内质网应激水平明显升高。

西洛他唑对海马神经干细胞糖氧剥夺性损伤的影响及其作用机制

目的探讨抗血小板药西洛他唑对糖氧剥夺诱导海马神经干细胞(NSCs)损伤的保护作用,以及活化转录因子4(ATF-4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路与西洛他唑保护性作用的关系。方法采用分离培养的新生C57BL/6幼鼠海马NSCs建立糖氧剥夺性NSCs损伤模型。将NSCs随机分为对照组、模型组、西洛他唑组、siRNA空白对照组、ATF-4 siRNA组。在接受糖氧剥夺3 h和药物作用24 h后,CCK-8法检测海马NSCs的增殖活力,免疫印迹法(Western Blotting)检测ATF-4、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达量,采用针对NSCs标志分子巢蛋白(Nestin)的免疫荧光检测鉴定NSCs。结果免疫荧光检测显示分离培养的海马NSCs呈现典型Nestin阳性。CCK-8法检测和Western Blot检测结果显示,与对照组比较,模型组海马NSCs的增殖活力明显下降(P<0.01),Bax/Bcl-2、ATF-4和CHOP表达明显上调(P<0.01);高剂量西洛他唑组与模型组比较,ATF-4 siRNA组与SiRNA空白对照组比较,海马NSCs的增殖活力明显上调(P<0.01),凋亡指数Bax/Bcl-2、ATF-4和CHOP表达明显下调(P<0.01)。结论西洛他唑对糖氧剥夺诱导的海马NSCs损伤具有保护作用,其机制与抑制ATF-4、CHOP信号通路有关。

内质网应激信号通路PERK与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系

目的探究内质网应激信号通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)与动脉粥样硬化(AS)斑块稳定性的关系。方法选取2021年2月—2023年2月收治的150例有AS斑块患者作为观察组,另选取150例健康体检者作为对照组。比较2组PERK信号通路相关因子水平,分析PERK信号通路相关因子对AS斑块发生风险的影响;比较不同斑块性质患者临床资料、PERK信号通路相关因子,分析PERK信号通路相关因子与血脂指标的相关性及对AS斑块稳定性的影响;受试者工作特征曲线评价PERK信号通路相关因子对AS斑块稳定性的预测价值。结果观察组血清PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)水平较对照组高(P<0.01)。当血清PERK、CHOP及ATF4处于高水平时,AS斑块发生风险分别是低水平的2.947倍、1.586倍、1.727倍。稳定斑块患者总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、PERK、CHOP及ATF4低于不稳定斑块患者,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)高于不稳定斑块患者(P<0.01)。AS斑块患者PERK、CHOP、ATF4分别与TC、LDL-C、TG呈正相关,与HDL-C呈负相关(P<0.01)。PERK、CHOP、ATF4是AS斑块不稳定的影响因素(P<0.01)。PERK、CHOP、ATF4联合预测AS不稳定斑块的曲线下面积为0.929,较各因子单独预测AUC明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论PERK信号通路参与AS斑块发生发展,与血脂指标TC、LDL-C、TG、HDL-C显著相关。检测PERK信号通路相关因子,有助于临床预判AS斑块性质。

布雷菲德菌素A对HepG2细胞自噬的诱导作用

为探讨新型抗癌药物布雷菲德菌素A(BFA)诱导肝癌细胞发生自噬性死亡的作用机制,以HepG2细胞作为研究对象,将细胞分成阴性对照组、不同浓度BFA组和阳性对照组(雷帕霉素),采用MTT法测定HepG2细胞活性;采用免疫荧光法检测细胞内自噬标志蛋白LC3的表达和细胞核形态学改变;采用Western Blot法检测细胞内激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)、增殖细胞核抗原(PCNA)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关蛋白5(Atg5)、自噬相关蛋白6(Atg6/Beclin-1)的表达水平.结果表明,BFA可引起HepG2细胞内自噬特征蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的蛋白表达水平明显增加;同时引起HepG2细胞活性降低、细胞数量减少、细胞核固缩和变形.说明BFA可能引起HepG2细胞发生自噬性细胞死亡.进一步探讨自噬诱导途径发现,BFA引起HepG2细胞内ATF4、CHOP的蛋白表达水平增加.BFA可能通过诱导ATF4和CHOP的过表达引起HepG2细胞发生自噬性细胞死亡.

地黄饮子抑制能量障碍诱导的APP/PS1小鼠内质网应激及神经元凋亡的作用机制

目的：研究地黄饮子对能量代谢障碍诱导的APP/PS1转基因小鼠内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）活性转录因子4（activating transcription factor4,ATF4）/C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）信号通路激活及其引发的神经元凋亡的作用机制。方法：4月龄APP/PS1转基因小鼠120只,随机分为正常组、模型组、阳性药（安理申,1 mg·kg-1）组、地黄饮子低、中、高剂量组（1.25,2.5,5 g·kg-1）。除正常组外,其余各组均腹腔注射100 mg·kg-1剂量的3-硝基丙酸（3-NP）,正常组小鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水。经灌胃给予地黄饮子和安理申1周。实时荧光定量聚合酶链式方应（Real-time PCR）检测小鼠脑组织ATF4,CHOP mRNA水平。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠脑组织内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）,ATF4,CHOP,B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）,Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）蛋白表达水平。末端标记法（TUNEL）染色观察小鼠脑组织神经元凋亡,并计算凋亡率。结果：与正常组比较,3-NP诱导的能量代谢障碍可以显著增加ERS标记性蛋白GRP78表达量（P〈0.01）,提高ATF4,CHOP mRNA水平（P〈0.01）和蛋白表达水平（P〈0.01）,下调抗凋亡蛋白Bcl-2（P〈0.01）和上调促凋亡蛋白Bax（P〈0.01）,增加模型小鼠脑组织神经元凋亡率。与模型组比较,地黄饮子各剂量组能显著降低模型小鼠脑组织GRP78表达水平（P〈0.05,P〈0.01）,ATF4,CHOP基因mRNA（P〈0.05,P〈0.01）及蛋白（P〈0.05,P〈0.01）水平;能够上调抗凋亡蛋白Bcl-2（P〈0.05,P〈0.01）,下调促凋亡蛋白Bax（P〈0.05,P〈0.01）,减少脑组织神经元凋亡。TUNEL结果显示地黄饮子可以显著减少小鼠脑组织神经元凋亡率。结论：地黄饮子可以抑制能量代谢障碍导致的ERS,抑制ATF4/CHOP信号通路激活,调节凋亡相关蛋白,显著减少神经元凋亡。

槲皮素对子宫颈癌荷瘤小鼠移植瘤生长的影响及其机制

目的探讨槲皮素对子宫颈癌荷瘤小鼠移植瘤的抗肿瘤作用,并分析其作用机制。方法将Hela细胞接种于裸鼠皮下建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤小鼠随机分为模型组、阳性对照组、实验组,每组10只。连续给药14 d后,计算肿瘤体积及抑瘤率,用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡情况,用蛋白质印迹法检测蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、真核起始因子2α(eIF 2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、转录激活因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达水平。结果模型组、阳性对照组和实验组小鼠的肿瘤体积分别为(1.53±0.20),(1.04±0.31),(1.12±0.37)cm3;模型组、阳性对照组和实验组肿瘤细胞凋亡率分别为0,(48.39±7.51)%,(45.44±6.20)%;模型组、阳性对照组和实验组PERK蛋白相对表达水平分别为0.74±0.15,0.61±0.23,0.50±0.14;模型组、阳性对照组和实验组p-PERK蛋白相对表达水平分别为0.65±0.09,1.02±0.20,1.64±0.12;模型组、阳性对照组和实验组eIF2α蛋白相对表达水平分别为0.66±0.11,0.40±0.21,0.42±0.18;模型组、阳性对照组和实验组p-eIF2α蛋白相对表达水平分别为0.58±0.13,1.15±0.25,1.30±0.17;模型组、阳性对照组和实验组ATF4蛋白相对表达水平分别为0.31±0.06,0.53±0.05,0.72±0.09;模型组、阳性对照组和实验组CHOP蛋白相对表达水平分别为0.26±0.07,0.39±0.04,0.63±0.10,模型组与阳性对照组比较或实验组和模型组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论槲皮素对人宫颈癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制与通过诱导PERK和eIF2α蛋白磷酸化,上调ATF4及CHOP表达,激活内质网应激有关。

水苏碱对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织蛋白激酶R样内质网激酶表达的影响

目的探讨水苏碱对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)表达的影响。方法建立单侧输尿管梗阻诱导大鼠肾间质纤维化的动物模型;将大鼠随机分为假手术组,模型组,依那普利组,水苏碱高、中、低剂量组;于术后第14天处死大鼠收集血清测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);采用HE染色观察肾脏的病理改变及评定肾小管损伤指数;Masson染色观察肾间质胶原沉积的面积,判断肾间质纤维化程度;采用免疫组织化学方法检测肾组织中PERK、激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。结果各治疗组与模型组比较,BUN、Scr均明显降低,肾小管损伤程度明显减轻,肾间质胶原相对面积和PERK、ATF4、CHOP的表达显著降低(P<0.05、0.01)。与依那普利组比较,水苏碱高剂量组的抗肾间质纤维化作用更为显著(P<0.05)。结论水苏碱能够抑制PERK信号通路介导ATF4蛋白表达水平升高及ATF4激活CHOP的蛋白表达,阻止细胞凋亡,从而减缓了肾间质纤维化的发生和发展。