The Effect of Parity on Conjugated Linoleic Acid(CLA) Content in Milk Fat and CLA-Desaturase Index from Holstein Dairy Cows

The performance of lactating dairy cows and composition of the fatty acids in milk fat were measured to investigate the effect of parity on conjugated linoleic acid(CLA)in milk fat and△~9-desaturase indices from Holstein dairy cows.Milk samples of two hundred and thirty-five lactating Holstein dairy cows in north China were tested.In order to avoid possible confounding effects of diet and season,Holstein cows were fed a single diet and milk was sampled on the same day.The average content of cis-9,trans-11 CLA was 5.14 mg/g fatty acids in milk fat,varying between 1.5 and 10.5 mg/g fatty acids.The average content of cis-9,trans-11 CLA of primiparous cattle was 5.19 mg/g fatty acids in milk fat,while it was 5.11 mg/g fatty acids in multiparous animals,with no significant difference between them(P】0.05).There was a significant(P【0.05)difference between the△~9-desaturase index of cis-9 C14:l and cis-9 C16:l between primiparous and multiparous cattle but not(P】0.05)in the△~9-desaturase index of cis-9 C18:l and cis-9,trans-11 CLA.

被孢霉cDNA文库的构建及△^9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因 ,构建了基于λgt1 0的被孢霉cDNA文库。cDNA文库库容量为 2× 1 0 6pfu。以已克隆的被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选。经过两轮筛选获得 1个阳性克隆 ,其插入片段长度大于 1 6kb。

被孢霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ－亚麻酸、花生四烯酸和ＥＰＡ等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题，我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的分析，合成一组简并引物，ＰＣＲ扩增了被饱霉Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢囊Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因保守区由５３７个核苷酸组成，共编码１７９个氨基酸。

奶牛胎次对乳中CLA含量和△^9-去饱和酶指数的影响

选择235头健康的中国北方荷斯坦奶牛为研究对象，为避免日粮和季节的影响，奶牛饲喂同种日粮，采集同一天的乳样，测定奶牛泌乳性能和乳脂肪酸组成，研究胎次对乳中CLA含量和△^9-去饱和酶指数的影响。研究结果表明：乳中c9，t11 CLA含量平均为5．14mg／g脂肪酸，变化范围1．5～10．5mg／g脂肪酸。初产奶牛的c9，t11 CLA平均含量为5．19mg／g脂肪酸，而经产奶牛的c9，t11 CLA平均含量为5．11mg／g脂肪酸，但二者间差异不显著（P〉0．05），初产与经产奶牛之间的c9 C14：1去饱和酶指数和c9 C16：1去饱和酶指数差异显著（P〈0．05）。初产奶牛的c9 C18：1去饱和酶指数和c9，t11 CLA去饱和酶指数与经产奶牛的差异不显著（P〉0．05）。

产奶量对乳中c9,t11CLA含量和乳腺△^9-去饱和酶指数的影响

以北方荷斯坦奶牛为研究对象,研究产奶量对乳中c9,t11CLA含量的影响。选择饲喂同种饲料的235头健康荷斯坦奶牛,采集同一天的乳样,避免日粮和季节的影响。通过线性分析,探讨产奶量对乳中c9,t11CLA含量和乳腺△9-去饱和酶指数的影响。结果表明,奶牛产奶量与乳中c9,t11CLA含量和乳腺△9-去饱和酶指数的线性模拟发现,其R2值均小于0.01。结论:奶牛产奶量对乳中c9,t11CLA含量和△9-去饱和酶指数影响很小,所以想提高乳中共轭亚油酸含量,不需要考虑产奶量的不同。

大头金蝇酰基辅酶AΔ9去饱和酶cDNA克隆与原核表达

为深入研究大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)脂肪酸代谢关键功能基因酰基辅酶AΔ9去饱和酶(ACD9des),运用RT-PCR和RACE技术,获得其cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。大头金蝇ACD9des基因cDNA (GenBank登录号为KF835695)全长1 429 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 146 bp,编码381个氨基酸,5'UTR长度为138 bp,3'UTR约为114 bp。ORF编码的蛋白质分子量为43. 47 kD,等电点9. 06,氨基酸序列与其他昆虫酰基辅酶A去饱和酶一致性高达66%-93%,且含有由7个酰基辅酶A去饱和酶蛋白家族特有的保守模式(motif)所构成的指纹(IPR015876)。大头金蝇ACD9des在进化上与葱蝇Delia antiqua最趋于一致。将ACD9des的ORF克隆到原核表达载体p ET-44a(+),并利用Rosetta (DE3)感受态细胞进行ACD9des原核表达。Western Blot分析表明,IPTG诱导表达的特异性蛋白可以与anti-His抗体特异性结合,大小与预期理论值(43. 47 kDa)相符,为ACD9des。该蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。最后利用含250 mM咪唑洗脱液和镍离子亲和层析柱对扩大培养获得的重组蛋白进行了纯化收集。本文的研究结果为大头金蝇功能基因的深入研究提供了坚实的基础。

固始-安卡鸡F_2资源群△-9脂肪酸脱氢酶基因第4、5、6外显子SNP及其与脂肪酸相关性研究

利用PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)方法,对固始-安卡鸡F2代资源群△-9脂肪酸脱氢酶基因第4、5、6对外显子多态性进行分析,发现存在一个单核苷酸多态(SNP,single nucleotide polymorphisms)位点。在△-9脂肪酸脱氢酶基因第4外显子编码区(89nt)发生了碱基的转换突变(G→A)。在整个F2代资源群中进行了该多态位点与脂肪酸性状的相关分析,结果表明:在8个脂肪酸性状中,AA型个体十六碳二烯酸(C16∶2)含量显著高于GG型和GA型个体(P<0.05);家系1中AA型的C16∶0、C16∶2、C18∶0含量均显著高于GG型和GA型(P<0.05);家系3中AA型的C14∶0含量显著高于GG型和GA型(P<0.05)。

油用牡丹△~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)生物信息学分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-ACP desaturase,SAD)是控制植物油脂中饱和与不饱和脂肪酸比例的关键酶之一。利用生物信息学在线工具,对油用牡丹—凤丹(Paeonia ostii)Po-SAD的氨基酸序列特征、理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构进行预测,并利用MEGA6.0构建了不同植物SAD分子进化树。结果表明:Po-SAD蛋白在相对分子量、理论pI与芍药、拟南芥的SAD相近,属于稳定的、可溶性蛋白。二级结构包括α螺旋(40.91%)、延伸串(12.37%)和不规则卷曲(46.72%),Po-SAD含有35个磷酸化位点和6个糖基化位点,亚细胞定位在质体中。进化树分析表明,凤丹Po-SAD与芍药的高度同源且亲缘关系最近。

蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。

绿色巴夫藻脂肪酸去饱和酶的克隆和初步研究(英文)

在高等植物中,Δ9脂肪酸去饱和酶引入第一个双键到饱和的脂肪酸链中,导致单不饱和脂肪酸的形成。我们通过RT-PCR、RNA ligase mediated RACE(RLM-RACE)and Overlap-PCR方法从海洋微藻绿色巴夫藻中克隆到一个命名为PvfadA的脂肪酸去饱和酶候选基因。通过将PvfadA基因在大肠杆菌表达系统中成功表达,PvFadA可以特异性地将C18∶0脂肪酸转变成C18∶1脂肪酸。PvFadA的氨基酸序列中存在一个存在于acyl-ACP去饱和酶的特异性金属离子结合区段(D/E)X2HX～100(D/E)X2H。通过同源模建PvFadA的3D结构显示,其包含了11个α螺旋,其中α3、α4、α6和α7组成了一个4个螺旋桶的核心结构,预测其可能是酶的活性中心。PvFadA的3D结构类似于蓖麻和结核分枝杆菌H37Rv的acyl-ACP去饱和酶。

牛SCD基因研究进展

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是催化主要包括棕榈酰CoA(C16:0)、硬脂酰CoA(C18:0)在内的饱和脂肪酸(SFA)产生单不饱和脂肪酸(MUFA)合成的关键酶,对牛奶、脂肪组织中脂肪酸的组成以及肌肉间脂肪沉积有着重要影响。文章概述了近年来牛SCD基因相关的研究进展。

续随子ElSAD2基因的克隆与功能分析

Δ^(9)-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是参与植物不饱和脂肪酸生物合成的关键酶。该研究从续随子(Euphorbia lathyris)种子转录组数据库中筛选得到续随子ElSAD2基因序列,对其序列表达特性进行分析,并鉴定ElSAD2基因的功能。结果显示:(1)续随子ElSAD2的cDNA全长1665 bp,ORF为1194 bp,编码397个氨基酸残基;系统进化分析显示ElSAD2蛋白与蓖麻(Ricinus communis)RcSAD1蛋白等亲缘关系较近。(2)ElSAD2在续随子各器官中均有表达,其中在花后30 d种子中表达量最高。(3)在BY4389缺陷型酵母中过表达ElSAD2,使缺陷酵母不饱和脂肪酸含量升高。(4)本氏烟草瞬时表达ElSAD2,使得烟草叶片总油脂和油酸含量分别提高2.46%和2.1%。研究发现,ElSAD2能催化单不饱和油酸的生物合成,可进一步应用于油料植物油脂产量和品质改良。

酿酒酵母脂酰-△9脱氢酶亚细胞定位表达及其对烟草脂肪酸合成的影响

以烟草Nicotiana tabacum L.为宿主植物,分别在细胞质内质网和质体内定位表达酿酒酵母Saccharomyees cerevisiae脂酰-CoA-Δ9脱氢酶(ScΔ9D),以期提高植物组织中棕榈油酸(16∶1Δ9)的积累量和分析该酶不同亚细胞定位表达对油脂代谢的影响。与野生型和空载体(对照)植物相比,转基因烟草植株叶片中单不饱和的棕榈油酸及顺式十八碳烯酸(18∶1Δ11)含量明显提高,而饱和的棕榈酸(16∶0)含量相应减少,多不饱和的亚油酸(18∶2Δ9,12)和亚麻酸(18∶3Δ9,12,15)含量亦降低。ScΔ9D质体定位表达烟叶中棕榈油酸及顺式十八碳烯酸含量分别是ScΔ9D细胞质内质网定位表达烟叶的2.7和1.9倍。这表明酵母脂酰-Δ9脱氢酶能在高等植物细胞中正确催化棕榈酸(16∶0)转化为棕榈油酸(16∶1Δ9),而且在质体内表达的效应显著高于在细胞质内质网上的效应。新建立了一种应用脂酰-CoA-Δ9脱氢酶代谢工程培育植物组织高水平合成积累棕榈油酸等ω-7脂肪酸的策略,有助于在生物量大的烟叶等营养器官中组装ω-7脂肪酸合成途径以生产优质生物燃油。

植物ω-7脂肪酸的系统代谢工程

ω-7脂肪酸(C16:1△9,C18:1△11,C20:1△13),特别是棕榈油酸(C16:1△9)具有重要的工业、营养和医药价值。这些珍稀脂肪酸大多在一些野生植物的种子中合成,不能商业化生产。对普通油料作物的油脂代谢途径进行遗传修饰,使其种子大量合成并积累ω-7脂肪酸,已成为生物技术和可再生资源研究的一个热点领域。基因操作的主要靶标包括:不同来源的△9脱氢酶的应用、提高底物(C16:0)的浓度、共表达质体型和内质网型?9脱氢酶以及代谢物流的优化等。该文在解析ω-7脂肪酸生物合成途径及其调控网络的基础上,重点论述了ω-7脂肪酸代谢工程的技术策略、研究进展和存在的问题,并进一步讨论了油脂物组学和转基因组学等组学技术在鉴定参与ω-7脂肪酸生物合成途径及其调控的特异基因和优化油脂代谢工程设计上的应用前景。

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACPΔ~9脱氢酶(stearoyl-ACPΔ~9 desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】使用HMM和Blastp鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】(1)在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;(2)系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;(3)启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;(4)IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。(5)沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。