腺病毒介导过表达ANT1基因诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶1(adenine nucleotide translocase 1,ANT1)对大鼠VSMCs凋亡的影响。方法用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)感染VSMCs,采用激光共聚焦观察Hoechst33258染色后细胞凋亡情况,流式细胞术检测Annexin V标记细胞凋亡率。Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果激光共聚焦观察转染Ad-ANT1后48 h细胞出现凋亡,且凋亡率[(13.40±1.14)%]与转染空载体对照组[(1.80±0.84)%]相比较差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测转染Ad-ANT1后48 h细胞凋亡率[(10.66±1.75)%]明显高于转染空载体组细胞[(3.13±0.37)%](P<0.05)。Western blot结果显示转染Ad-ANT1后Bax蛋白表达明显高于转染空载体组,Bcl-2蛋白表达2组比较无明显差异。结论腺病毒介导过表达ANT1可诱导大鼠VSMC的凋亡,其机制可能通过上调Bax实现。

H.pylori对胃癌细胞线粒体膜蛋白ANT1表达的影响

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori,HP)作用于胃癌细胞后线粒体膜蛋白ANT1 mRNA及蛋白的表达变化,探讨H.pylori致胃癌的分子机制。方法HP分别作用于胃癌细胞0、12、24、48h后,收集细胞,应用RT-PCR和Western blot法检测各时相点ANT1基因和蛋白表达变化。结果HP与胃癌细胞共培养12h后,ANT1 mRNA的表达增加,24h增加更明显,48h达到高峰。各时相点的表达量明显高于对照组(P<0.05)。ANT1蛋白表达在各时相点均增加,明显高于对照组(P<0.05)。结论HP可上调胃癌细胞线粒体膜蛋白ANT1 mRNA及蛋白的表达,影响线粒体膜通透性改变,这可能是HP通过线粒体途径诱发凋亡的分子靶点之一。

转染ANT1基因诱导颈动脉球囊损伤大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的通过腺病毒载体在体转染大鼠颈总动脉球囊损伤模型,研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶-1(adeninenucleotide translocase 1,ANT1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法将72只雄性SD大鼠随机分为正常组、单纯损伤组、Ad-GFP转染组、Ad-ANT1转染组,每组18只。用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)局部感染大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型,在损伤后7、14、28 d,取大鼠损伤侧颈动脉RT-PCR检测ANT1 mRNA表达,West-ern blot以及免疫组化检测BAX和Bcl-2表达,TUNEL法原位检测新生内膜及中膜VSMCs凋亡率。结果 Ad-ANT1腺病毒转染后大鼠颈动脉ANT1大量表达,在14 d达到高峰,显著高于Ad-GFP转染组及单纯球囊损伤组(P<0.01),至28 d时仍有表达。在7、14 d时,Ad-ANT1转染组BAX阳性表达率显著高于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05);Bcl-2阳性表达率高于正常血管,但与Ad-GFP转染组和单纯损伤组无显著差异(P>0.05);Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜平滑肌细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05);在14、28 d时,Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜面积比(IA/MA)小于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05)。结论腺病毒载体介导过表达ANT1可诱导大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型新生内膜及中膜VSMC的凋亡,其作用可能通过上调促凋亡蛋白BAX的表达实现。

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化大鼠腺苷酸转运体(ANT1)蛋白并制备其多克隆抗体.方法:通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果:成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×103的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×103的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.

腺嘌呤核甘酸转运子-1在大鼠压力超负荷致心肌重塑中的表达

目的:探讨心肌线粒体腺嘌呤核甘酸转运子-1(adeninenucleotidetranslocator-1,ANT1)对压力超负荷致心肌重塑的影响。方法:利用腹主动脉缩窄法建立大鼠压力超负荷模型,假手术组大鼠3只作为对照组。观察时间点为术后1,2,4,7,14,21和30天。ANT1mRNA含量的测定采用RT-PCR法,利用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡。心肌纤维化的改变采用心肌胶原形态定量分析。结果:①与对照组比较,缩窄后4天ANT1mRNA的含量上调,并于第7天达到峰值,术后14天其含量回落至对照组水平,并保持至30天。②手术组心肌细胞凋亡在术后1天即升高,在4天时进入高峰期并持续至7天,其后低水平持续存在,直至实验结束。而对照组未发现凋亡的存在。③与对照组比较,心肌胶原容积分数于术后14天方明显增加,并持续增高。结论:ANT1参与了压力超负荷致心肌重塑早期心肌细胞凋亡的调节,并可能影响了这一过程的发生和发展。

幽门螺杆菌重组空泡细胞毒素A片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1基因表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(HP)重组空泡细胞毒素A(VacA)片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1(ANT1)基因表达的影响。方法HPVacA基因片段重组质粒转染AGS细胞后,分别于0、24、48、72 h收集细胞,提取总RNA和总蛋白,应用逆转录聚合酶链式反应和蛋白印迹法检测各时相点ANT1基因的mRNA和蛋白表达变化。结果重组VacA基因片段质粒转染AGS细胞后,ANT1基因mRNA和蛋白表达均随时间呈逐渐升高趋势,各时相点的表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论HP可能通过上调ANT1基因的表达,使线粒体膜通透性改变,引起细胞凋亡。

HPV感染宫颈病变危险因素及cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达水平

目的探讨环鸟嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸合成酶/干扰素激活蛋白/TANK结合激酶1(cGAS/STING/TBK1)信号通路基因在HPV感染宫颈病变患者中的表达及其易感因素。方法回顾性分析2019年3月-2023年3月吉安市中心人民医院收治的151例人乳头瘤病毒(HPV)感染宫颈病变患者的临床资料,并作为研究组,151例同期无HPV感染的宫颈病变患者的临床资料作为对照组。比较两组临床资料,采用单因素及多因素分析法分析宫颈病变患者HPV感染的易感因素;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测cGAS、STING、TBK1mRNA表达水平;比较研究组和对照组cGAS、STING、TBK1mRNA表达水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析cGAS、STING、TBK1单独及联合检测对宫颈病变患者HPV感染的诊断价值。结果多因素Logistic回归分析结果显示,年龄大、既往宫颈炎病史、性生活频率高、未使用避孕套、性生活前后无外阴清洗、初次性生活年龄≤20岁、有宫颈癌家族史、初中及以下文化、性伴侣个数≥2个均是宫颈病变患者HPV感染的易感因素(P<0.05);研究组cGAS、STING、TBK1 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);cGAS、STING、TBK1水平联合检测诊断宫颈病变患者HPV感染的曲线下面积(AUC)为0.902,高于各项单独检测(P<0.05),且联合检测的敏感度和特异度为82.80%和82.10%,诊断价值均较高。结论宫颈病变患者HPV感染后cGAS/STING/TBK1信号通路被激活;联合检测cGAS、STING、TBK1有助于诊断宫颈病变患者HPV感染;宫颈病变患者HPV感染与患者年龄、宫颈炎病史、性生活频率等多种因素有关。

卵巢癌肿瘤干细胞对顺铂和盐霉素的药物敏感性

目的检测卵巢癌干细胞对盐霉素、顺铂的药物敏感性,并比较两者对卵巢癌干细胞的杀伤作用。方法采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞株SKOV-3中分离肿瘤干细胞,并采用流式细胞技术检测干细胞标志性因子CD44。人卵巢癌SKOV-3细胞及人卵巢癌干细胞经盐霉素、顺铂作用48h后,采用CCK-8比色法检测细胞存活率,计算半数致死量(IC50)。取第48小时时间点的半数抑制浓度作用于悬浮培养的第5代悬浮细胞48h后,收集药物生存细胞(DSC),采用RT-PCR技术检测DSC的三磷酸腺苷结合转运蛋白B1(ABCB1)基因及三磷酸腺苷结合转运蛋白G2(ABCBG2)基因的转录水平。结果无血清悬浮培养法富集的人卵巢癌微细胞球高表达CD44抗原。盐霉素、顺铂作用第48小时时间点的卵巢癌SKOV-3细胞的IC50分别为(62.50±2.53)和(3.62±0.38)μmol/L,卵巢癌干细胞IC50分别为(48.81±2.83)和(3.80±0.22)μmol/L。卵巢癌干细胞对顺铂耐药指数(RI)为2.12±0.41,明显高于盐霉素RI(0.78±0.08),两者差异有显著意义(t=6.22,P<0.05)。盐霉素组DSC细胞ABCB1和ABCBG2基因表达水平明显低于顺铂组(t=7.49、9.75,P<0.05)。结论人卵巢癌干细胞对盐霉素药物敏感性显著高于顺铂。盐霉素对卵巢癌干细胞的杀伤作用大于顺铂。该差异可能与干细胞高表达ABCB1、ABCBG2基因有关。

鱼腥草素钠对BALB/c小鼠的急性毒性及其对细胞的损伤

目的探索鱼腥草素钠(SH)急性毒性及其对腹腔细胞的损伤作用。方法观察BALB/c小鼠单次ip给予SH 50,125和200 mg.kg-1后的急性毒性反应及死亡情况,并进行病理组织学检查。检测小鼠单次ip给予SH后血浆中组胺的浓度。将SH与小鼠腹腔细胞进行体外孵育,检测乳酸脱氢酶(LDH)渗出和组胺释放。观察SH对人血红细胞的溶血作用。结果小鼠单次ip给予SH后,SH 50 mg.kg-1组没有观察到小鼠死亡,SH 200 mg.kg-1组小鼠全部死亡,死亡原因为肝充血。与正常对照组血浆中组胺浓度(45.8±9.6)μg.L-1相比,小鼠ip给予125 mg.kg-1后0.5 h血浆中组胺浓度为(66.1±3.9)μg.L-1,明显增加(P<0.05)。SH 0,32和128 mg.L-1体外处理小鼠腹腔细胞,上清中的相对含量LDH分别为1.2±1.1,19.2±3.3和30.6±3.1,组胺的浓度分别为36.5±9.0,73.3±3.8和(82.7±3.6)μg.L-1,与正常对照组相比明显增加(P<0.05)。溶血实验发现,SH能够引起小鼠及人血红细胞显著的溶血现象。结论 SH对小鼠具有一定的急性毒性,可引起小鼠腹腔细胞LDH和组胺的释放,并且SH具有溶血作用。

高危型HPV感染宫颈病变患者外周血cGAS/ STING/TBK1信号通路基因表达

目的 探究高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染宫颈病变患者外周血环鸟嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸合成酶/干扰素激活蛋白/TANK结合激酶1(cGAS/STING/TBK1)信号通路基因相对表达量。方法 选取2015年4月-2021年4月中部战区总医院妇产科收治的高危型HPV感染宫颈病变患者89例为研究组,同期无HPV感染的宫颈病变患者89例为对照组,采用第2代杂交捕获实验检测高危型HPV DNA载量,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测外周血cGAS、STING和TBK1 mRNA表达水平。结果 研究组外周血单个核细胞中cGAS、STING和TBK1 mRNA水平高于对照组(P<0.05);不同高危型HPV DNA载量患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达的比较差异有统计学意义(P<0.05),其中高载量组cGAS、STING和TBK1 mRNA水平最高,低载量组最低(P<0.05);不同高危型HPV感染类型患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达的比较差异无统计学意义。结论 高危型HPV感染对宫颈病变患者外周血cGAS/STING/TBK1信号通路基因表达影响较大,高危型HPV DNA载量与其表达水平密切相关。