Adeno-associated Virus Mediated LacZ Gene Transfect to Cultured Human Iris Pigment Epithelium Cells

Purpose: To study the feasibility of adeno-associated virus mediated gene transfection tocultured human iris pigment epithelium (IPE) cells in vitro.Methods: Recombinant replication deficient adeno-associated viruses (AAV) expressingLacZ gene were produced without helper virus. The LacZ gene was transduced into culturedhuman IPE cells.Results: Cultured human IPE cells stained positively anticytokeratin, The titer ofrAAV-LacZ was 2.1 × 108 virus particles/ml, 42% cultured human IPE cells expressedβ-galactosidase 7 days after transfection and 67% after 14 days.Conclusions: Recombined AAV produced without helper virus can transfer a foreign geneinto human IPE cells with high efficiency in vitro.

Gene Therapy Activates Retinal Pigment Epithelium Cell Proliferation for Age-related Macular Degeneration in a Mouse Model

Objective Age-related macular degeneration(AMD)is a degenerative retinal disease.The degeneration or death of retinal pigment epithelium(RPE)cells is implicated in the pathogenesis of AMD.This study aimed to activate the proliferation of RPE cells in vivo by using an adeno-associated virus(AAV)vector encodingβ-catenin to treat AMD in a mouse model.Methods Mice were intravitreally injected with AAV2/8-Y733F-VMD2-β-catenin for 2 or 4 weeks,andβ-catenin expression was measured using immunofluorescence staining,real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(PCR),and Western blotting.The function ofβ-catenin was determined using retinal flat mounts and laser-induced damage models.Finally,the safety of AAV2/8-Y733F-VMD2-β-catenin was evaluated by multiple intravitreal injections.Results AAV2/8-Y733F-VMD2-β-catenin induced the expression ofβ-catenin in RPE cells.It activated the proliferation of RPE cells and increased cyclin D1 expression.It was beneficial to the recovery of laser-induced damage by activating the proliferation of RPE cells.Furthermore,it could induce apoptosis of RPE cells by increasing the expression of Trp53,Bax and caspase3 while decreasing the expression of Bcl-2.Conclusion AAV2/8-Y733F-VMD2-β-catenin increasedβ-catenin expression in RPE cells,activated RPE cell proliferation,and helped mice heal from laser-induced eye injury.Furthermore,it could induce the apoptosis of RPE cells.Therefore,it may be a safe approach for AMD treatment.

Cultivation and Ultrastructural Investigation of Human Iris Pigment Epithelial Cells

Purpose; To study the human iris pigment epithelial cells cultivation in vitro. Methods: The iris pigment epithelial cells were isolated by scraping directly or by enzyme digestion and cultured in vitro. The cells were observed under the transmission electron microscope and analized by means of immunohistochemical assay.Results: The cells obtained by scraping were easier to grow and to be passaged than those obtained by enzyme digestion. The primary cells appeared multigonal and arranged in mono-layer. Abundant pigment granules were in the cytoplasm and diminished in succeeding generations . The maculae occludentes and desmosomes and microvilli which were characteristics of epithelial cells could be found under the electronmicroscope. The immunohistochemical assay showed positive reaction of keratin antigen in cultured cells.Conclusion: The human iris pigment epithelial cells could be cultured in vitro and the cells in primary generation some characteristics be preserved. Eye Science 1997; 13: 137 -

兔虹膜和视网膜色素上皮细胞的体外培养比较

目的 观察比较有色素兔虹膜色素上皮(IPE)及视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外生长状况。方法采用酶消化法及酶辅助机械分离法分别分离IPE和RPE细胞。观察培养的两种细胞的生长状况,并对其进行免疫组化鉴定。结果原代IPE及RPE细胞大多呈圆形或六边形,细胞内充满了黑色素颗粒。随着传代的增加,呈梭形或纤维细胞样生长的细胞增多,细胞中的色素颗粒也逐渐减少。细胞角蛋白免疫组化染色显示IPE及RPE细胞绝大多数呈棕黄色阳性反应。Desmin免疫组化染色显示IPE细胞中阳性细胞约占5％。 结论 分离培养的IPE和RPE细胞纯度很高,IPE细胞中绝大多数为后层IPE细胞。IPE和RPE细胞的形态及体外生长特点类似。

超声辐照人血白蛋白微球与腺相关病毒感染人视网膜色素上皮细胞

目的探讨超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球促进携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染人视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值。方法HRPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×105/孔),加入微球与rAAV2-EGFP的混合液,在不同条件下进行超声辐照。48h后,应用流式细胞仪测定阳性细胞比例,并且评估不同辐照条件对细胞增殖有无影响。结果在声强1.0W/cm2,辐照持续时间60s,微泡细胞比值60∶1的条件下,全氟丙烷人血白蛋白微球组EGFP阳性细胞比例较对照组显著提高(P<0.001),MTS染色细胞生存率大于90%。结论超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球能够安全地提高rAAV2-EGFP对人RPE细胞的感染效率。

兔眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的:体外培养和观察兔眼虹膜色素上皮细胞(IPEC),为临床和实验研究IPE细胞提供基础。方法:采用酶消化加酶辅助机械分离法分离IPE细胞,观察培养细胞的生长情况,并采用免疫荧光法对其进行鉴定。结果:原代培养的IPE细胞多数呈圆形或六边形,细胞内充满黑色颗粒。传代培养的IPE细胞呈梭形或纤维细胞样生长,细胞中的色素颗粒也逐渐减少。免疫荧光法对培养细胞进行cytokeratin染色显示IPE细胞成阳性反应,阳性率达100%。结论:采用酶消化加酶辅助机械分离法可成功地分离培养出IPE细胞。

人眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的 :观察体外培养的人眼虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium ,IPE)的生长状况 ,用透射电镜、细胞免疫化学实验鉴定其性质 ,为进一步研究IPE细胞生理、病理作用提供模型。方法 :对来源于不同个体的健康人眼采用酶消化加显微分离法 ,分离IPE细胞 ,对其进行培养、传代、冻存和复苏。用透射电镜、细胞免疫化学法鉴定细胞性质。建立IPE细胞的有限细胞系。结果 :原代培养的IPE呈棕黑色多角形或不规则形 ,2 4h内 73%细胞贴壁。贴壁细胞体积变大呈多边形或方形 ,胞核轮廓变清 ,胞浆内充满黑色素颗粒。分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少 ,4～ 6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失 ,部分形态变为成纤维细胞状。电镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛 ,胞浆内含少量色素颗粒。细胞免疫化学抗角蛋白与抗S 10 0染色显示IPE细胞胞质呈鲜红色着色。结论 :采用酶消化加显微分离法可以建立人IPE的有限细胞系。

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因 (GFP)对体外培养虹膜色素上皮 (IPE)细胞的转染和表达 ,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数 (MOI)为 10 3 、10 4、10 5、10 6转染已培养 3d的传二代IPE细胞 ,转染后的第 1、3、5、7、9d ,在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况 ,记录 10 0个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后 ,共聚焦显微镜照相 ,流式细胞仪检测rAAV GFP对IPE的转染效率。结果 rAAV GFP在细胞中的表达呈绿色 ,弥漫于整个胞浆。MOI =10 3 时 ,转染后 48h ,GFP开始表达 ,MOI =10 4、10 5、10 6时 ,转染后 2 4h时便可看到GFP表达阳性的细胞 ,细胞的起始表达强度不一 ,随MOI值的增高而增强 ,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强 ,转染后第 7～ 9d达到高峰并维持 ,此时检测rAAV GFP对IPE的转染效率 ,MOI =10 3 时是 2 6 7% ,MOI =10 4时是 5 3 6% ,MOI =10 5时是 60 2 % ,MOI =10 6时是 63 7%。结论 rAAV GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达 60 %以上 。

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染及毒性

目的 研究腺相关病毒 (recombinantadeno associatedvirus ,rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因 (greenfluorescentprotein ,GFP)对体外培养虹膜色素上皮细胞 (irispig mentepithelial,IPE)的转染和病毒载体对IPE细胞的毒性 ,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数 (multipleofinfection ,MOI)为 10 3 、10 4、10 5、10 6转染已培养 3d的传二代IPE细胞 ,流式细胞仪检测rAAV GFP对IPE的转染效率。MTT法检测rAAV GFP对IPE细胞的毒性。结果 rAAV GFP对IPE的转染效率 ,MOI =10 3 时为 2 6 .7%、MOI =10 4时为 5 3.6 %、MOI =10 5时为 6 0 .2 %、MOI =10 6时是 6 3.7% .AAV GFP转染IPE细胞后 ,细胞生长正常 ,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异。结论rAAV GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达 6 0 %以上 ,而且腺相关病毒对细胞生长无明显抑制 。

酶-机械分离-酶消化法分离培养兔眼虹膜色素上皮细胞

目的 建立兔眼虹膜色素上皮细胞体外培养体系。方法 采用酶 机械分离 酶消化法分离兔眼IPE细胞 ,台盼蓝染色法测定细胞活力 ,在体外对其进行原代及传代培养扩增 ,倒置相差显微镜观察IPE细胞的生长情况。取第 2次传代的IPE细胞行AE1/AE3及S 10 0抗体细胞免疫组化染色对其进行鉴定。结果 酶 机械分离 酶消化法分离得到IPE细胞的活力为 70 %～ 85 % .原代细胞 16～ 4 8h贴壁 ,72h后开始生长 ,细胞大多呈多角形或方形 ,少数为梭形 ,12～ 16d生长融合为单层细胞。第 1次传代的IPE细胞 6～ 12h贴壁 ,5～ 7d生长融合为细胞单层。IPE细胞在体外培养可传 5～ 6代。免疫组化染色显示 ,几乎所有细胞胞浆呈现棕黄色阳性反应 ,对照组胞浆不染色。结论 酶 机械分离 酶消化法分离培养兔眼IPE细胞易于操作 ,联合应用细胞角蛋白、S 10 0蛋白单克隆抗体的免疫组化技术可用来鉴定IPE细胞。

腺相关病毒介导bFGF基因对虹膜色素上皮细胞的转染及表达

目的:评价重组腺相关病毒(rAAV)载体介导碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染体外培养的虹膜色素上皮细胞(IPE)后,bFGF基因在细胞内转录和翻译水平的表达情况。方法:取IPE细胞,转染含有分泌型bFGF全长cDNA和巨细胞病毒启动子的rAAV-bFGF,以未转染和同样条件下转染rAAV-GFP的细胞作对照。1周后,RT-PCR检测细胞中bFGFmRNA的表达。ELISA法检测细胞中bFGF蛋白的表达。结果:转染rAAV-bFGF的IPE细胞有bFGFmRNA的表达,转染rAAV-GFP和未转染细胞无bFGFmRNA的表达。以105个细胞计算,转染rAAV-bFGF的IPE细胞bFGF蛋白含量为(1.322±0.663)μg/L,高于未转染组的(0.213±0.036)μg/L和转染rAAV-GFP组的(0.243±0.050)μg/L,差异有统计学意义(F=18.294,P=0.000)。结论:IPE细胞能被rAAV-bFGF转染,转染细胞能够在转录和翻译水平表达bFGF基因。

腺相关病毒介导色素上皮衍生因子转染人虹膜色素上皮细胞的体外研究

目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体,对体外培养的人虹膜色素上皮(IPE)细胞进行色素上皮衍生因子(PEDF)转染,获得高效表达PEDF转基因细胞的可行性。方法构建携带PEDF基因的重组AAV载体AAV-PEDF,体外培养人IPE,用1×106pfu的AAV-PEDF按感染复数(MO I)为0、2、10和20分别感染体外培养的IPE细胞;荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况;流式细胞术检测细胞转染效率;RT-PCR和W estern b lotting法鉴定PEDF在IPE细胞中的表达。结果 AAV-PEDF转染后,IPE细胞生长正常,用荧光显微镜、RT-PCR和W estern b lotting均检测到PEDF表达。在MO I为20时,细胞感染阳性率达64.22%。结论 AAV-PEDF能有效地转染体外培养的IPE细胞并有效表达PEDF。

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。

体外培养的兔虹膜色素上皮细胞吞噬功能及细胞连接的观察

目的:观察体外培养的虹膜色素上皮（iris pigment epithelium IPE）细胞是否具有吞噬功能及屏障作用。方法:将鸡红细胞悬液加入体外培养的IPE细胞内,计算其吞噬数量,电镜下观察IPE细胞间连接。结果:体外培养状态下,IPE细胞对鸡红细胞的吞噬率为5.4％,视网膜色素上皮（retinal pigmentepithelium RPE）细胞为8.8％（P<0.01）;IPE同RPE一样具有紧密连接结构。结论:兔IPE在体外培养状态下,具有吞噬功能及屏障作用。眼科学报2001;17:191～193。

TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用

目的寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法。方法采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率。结果TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%。胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%。结论TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果。

细胞移植在眼科临床的应用

细胞移植是组织修复的一种重要手段。目前己在眼科临床应用的有视网膜色素上皮细胞移植、虹膜色素上皮细胞移植、角膜缘干细胞移植、结膜上皮细胞移植和视网膜感光细胞移植等。本文复习了各种眼科细胞移植的现况及展望。对一些细胞移植的适应证、远期效果及潜在副作用均有待进一步研究。细胞移植与干细胞工程、基因工程及组织工程结合具有一定的发展前景。

虹膜周边切除手术标本的色素上皮细胞体外培养与超微结构研究

目的 :体外培养虹膜周边切除标本中的色素上皮细胞 (irispigmentepithelium ,IPE) ,并进行生物学检测。方法 :用酶 显微解剖 酶分离法培养IPE细胞并传代 ,免疫组化方法鉴定 ,透射电镜观察超微结构。结果 :酶 显微解剖 酶分离法在小标本可成功获得较高纯度和密度的IPE细胞。其形态与免疫标志物表达与视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞相似。结论 :培养的IPE细胞为自体移植提供了较可靠的细胞来源。

牛眼虹膜色素上皮细胞的甘露糖受体表达

目的 观察体外培养的牛眼虹膜色素上皮 (iris pigment epithelium,IPE)细胞是否具有与视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞相似的特异性吞噬视网膜感光细胞外节 (retinal outersegment,ROS)的功能。 方法 采用 Hu方法分离和培养新生牛眼 IPE细胞。以鼠抗细胞角蛋白抗体和鼠抗 S10 0抗体为一抗 ,采用免疫组织化学染色对培养的 IPE细胞进行鉴定。 Trizol一步法提取生长近融合的传 2代 IPE细胞的总 RNA。根据 Genbank中牛巨噬细胞甘露糖受体的相关系基因列设计特异引物 ,对其 m RNA的表达进行逆转录聚合酶链反应 (reverse transcription polymerase chain- reaction,RT- PCR)检测。 结果 培养获得的 IPE细胞无其它细胞污染 ,提取的 IPE细胞总 RNA完整 ,无降解。RT- PCR检测结果显示 ,体外培养牛眼 IPE细胞可表达甘露糖受体的 m RNA。 结论 体外培养的 IPE细胞可表达甘露糖受体的 m RNA,有可能具有与 RPE细胞相似的特异性

体外分离培养猪虹膜色素上皮细胞的生物学评价

目的 :培养猪的虹膜色素上皮 (IPE)细胞并进行IPE的生物学评价 ,为IPE移植治疗视网膜色素变性 (RP)打下基础。方法 :采用酶辅助的显微分离法对 5 0只猪眼进行IPE的原代和传代培养 ,免疫组化方法鉴定细胞 ,并对其生物学性状进行评价。结果 :从IPE生长曲线上看 ,细胞于接种后 2天开始进入细胞对数生长期 ,经过 3～ 4天的对数期生长后进入生长缓慢的平台期。细胞培养成功率为 85 0 %。原代细胞的贴壁率为 31 8%± 3 7% ,细胞的活力为 82 5 %± 5 1% ,传代细胞的贴壁率为 86 4 %± 4 3% ,细胞的活力为 91 2 %± 3 7%。伸展率为 83 6 %± 5 3% ,分裂时间为 2～ 7天 ,平均 3 5± 0 96天 ,总分裂次数为 6～ 10代。免疫组织化学显示 ,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白 (AE1/AE3)和S 10 0抗原染色均为阳性。结论 :对IPE细胞的生物学评价 ,不仅证实了IPE细胞高效纯化培养的实现 。

体外培养牛眼虹膜色素上皮细胞维生素A代谢相关蛋白mRNA的表达

目的 评价体外培养牛眼虹膜色素上皮 (irispigmentepithelial,IPE)细胞的维生素A代谢功能。方法 采用酶辅助的显微分离法和培养新生牛眼IPE细胞 ,Trizol一步法提取总RNA。根据Genbank中维生素A结合蛋白 (retinol bindingprotein ,RBP)和细胞内视醛结合蛋白 (cellularretinldehyde bindingprotein ,CRALBP)的相关系列设计特异引物 ,对其mRNA的表达进行逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerase chainreaction ,RT PCR)检测。结果 传 2代牛眼IPE细胞中提取的总RNA完整、无降解。RT PCR检测结果 :RBP及CRALBP的mRNA在培养的牛眼IPE细胞中均有表达。结论 牛眼IPE细胞具有与视网膜色素上皮细胞相似的维生素A转运和代谢功能。