重组hFGF-10腺病毒促进角质形成细胞增殖

目的:构建重组人成纤维细胞生长因子10(hFGF-10)腺病毒,并观察其对角质形成细胞增殖的影响,为探索新的皮肤组织工程种子细胞的来源奠定基础。方法:用PCR方法扩增得到人成纤维细胞生长因子10(hFGF-10)基因片段,与穿梭载体pAdTrack-CMV连接,获得的重组质粒pAdTrack-CMV-hFGF-10经PmeI线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-10,经酶切鉴定后转染HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增腺病毒。用重组腺病毒感染HaCat细胞,Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-10。MTT法检测重组腺病毒对角质形成细胞增殖的影响。结果:成功构建了含hFGF-10基因的重组腺病毒,可高效感染HaCat细胞,培养上清与hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒对角质形成细胞的增殖具有促进作用。结论:制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-10,并可促进HaCat细胞的增殖。

携带免疫基因的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒制备及功能验证

目的制备前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A,评价其体外溶瘤和免疫激活功能。方法以LNCaP细胞和Jurkat细胞的cDNA为模板,采用普通PCR和巢式PCR分别扩增获得前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)基因、CD40L-N基因和CD40L-C基因;并采用重叠PCR方法将PSA、Linker、CD40L-N和CD40L-C基因依次连接并扩增获得融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L(PL)。采用以Adeasy系统为基础的溶瘤腺病毒构建体系,构建并制备携带PL的溶瘤重组腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后不同时间点,流式细胞术检测细胞凋亡情况;50 MOI的Ad-PL-PPTE1A感染PC3M细胞,于48 h收集其裂解液,并将其作用于正常人外周血单个核细胞,CCK8检测细胞增殖能力。结果 PCR成功扩增并连接获得融合蛋白基因PL,构建并制备了携带PL基因的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。RTPCR和Western印迹检测结果显示,Ad-PL-PPT-E1A可在PC3M细胞中高效表达E1A和PL蛋白。将Ad-PL-PPTE1A感染PC3M细胞后,可见明显的细胞病变;同时,流式细胞检测结果显示,当感染滴度达到200 MOI时,48 h的凋亡率达到70.67%±2.98%。CCK8结果显示,Ad-PL-PPT-E1A感染后,可恢复PC3M细胞裂解液对人外周血单个核细胞的抑制作用。结论成功制备和鉴定了前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A,并在体外证实了其具有溶瘤和免疫的双重功能。