Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒

目的:建立Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒(RCA)。方法:首先制备高纯度的pXC1质粒参考品(含有E1基因序列),紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数;然后比较染料法和探针法的灵敏度,建立适用的Q-PCR检测方法;最后用新建Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。结果:pXC1质粒参考品的拷贝数初步标定为2.6×1010拷贝/μL;探针法的灵敏度比染料法高1000倍;将pXC1质粒参考品应用于Q-PCR(探针法)测定腺病毒基因治疗产品中的RCA,标准曲线回归方程为y=-1.416ln(x)+47.395,R^2=0.9966,供试品的Cq值均位于标准曲线范围内。结论:新建Q-PCR法适用于检测腺病毒基因治疗产品中的RCA,且结果准确可靠。

人7型腺病毒检测细胞系的构建与鉴定

目的构建人7型腺病毒（human adenovirus type 7，HAdV7）检测细胞系。方法将HAdV7中的Hexon基因克隆至带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EGFP（2A）-Puro上，获得pLV-EGFP-hexon。将其与包装质粒P-Pax、pMD用脂质体Lip2000共转染293T细胞，获得慢病毒颗粒感染HEp-2细胞，经嘌呤霉素压力筛选和系列的稀释法，获得HAdV7感染的检测细胞系HEp-2／GFP。结果细胞系HEp-2／GFP感染HAdV7后24h，可观察到GFP的表达绿色荧光，而作为对照组的HEp-2／GFP细胞感染双链DNA病毒（如EB病毒和乙型肝炎病毒），并未观察到绿色荧光。此检测细胞系用不同滴度的HAdV7感染，至少可以检测到10PFU／mL滴度的HAdV7。结论成功构建了能检测HAdV7的细胞系HEp-2／GFP，且其检测的特异性和敏感性良好，可以作为检测HAdV7感染的诊断方法之一。