体外诱导脂肪来源干细胞向黏膜上皮细胞分化的研究

目的探讨在体外诱导脂肪来源干细胞(ADSCs)分化为黏膜上皮细胞的可能性。方法获取成年人皮下脂肪组织,进行ADSCs的分离、培养,扩增至第三代进行细胞免疫表型、分化情况及遗传稳定性鉴定。分别采用含10%胎牛血清、8μg/L表皮生长因子(EGF)、10%胎牛血清+8μg/L EGF、10%胎牛血清+8μg/L EGF+30%成纤维细胞培养基、10%胎牛血清+30%成纤维细胞培养基的DMEM培养液进行培养,于培养前及培养后7、14d观察各组细胞的光镜特征,采用免疫组织化学染色检测特异性细胞表面标记物的表达以及Western blotting方法检测诱导前后ADSCs中CK-7、CK-14的蛋白表达水平。结果与未加EGF诱导剂培养组比较,经EGF诱导14d后多数ADSCs细胞形态、排列方式发生改变。CK-19免疫组化染色显示呈强阳性。Western blotting检测结果提示诱导后的黏膜上皮细胞特异性蛋白CK7、CK14呈高表达。结论 ADSCs在一定诱导条件下可向黏膜上皮样细胞分化。

不同方法诱导脂肪干细胞分化为类施万细胞

目的寻求一种有效的方法将脂肪干细胞在体外诱导分化为类施万细胞。方法采用2种不同的诱导剂使用方法诱导大鼠脂肪干细胞,从形态学、抗S-100、抗GFAP免疫细胞化学染色阳性率、染色灰度值,MTT法细胞活性测定来比较其效果的不同。结果2种方法均可有效地诱导大鼠脂肪干细胞分化为类施万细胞,改良法诱导的细胞在形态上更接近施万细胞,抗S-100、抗GFAP阳性率、染色灰度值均优于传统法;MTT细胞活性测定显示改良法对细胞活性影响较小。结论改良法体外诱导大鼠脂肪干细胞的效果优于传统法。

大鼠脂肪干细胞体外诱导为光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞

目的探讨大鼠的脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导为光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法。方法经贴壁筛选法连续传代纯化细胞,流式细胞仪检测CD45、CD90、CD49d、CD106鉴定ADSCs。用EGF、激活素A、牛磺酸、视黄酸和视网膜细胞提取液单独诱导ADSCs;用EGF＋牛磺酸、EGF＋视黄酸、牛磺酸＋视黄酸、EGF＋牛磺酸＋视黄酸联合诱导,免疫荧光法和流式细胞仪检测细胞的视紫红质、CK和S-100的表达。结果原代ADSCs,CD45阳性率是1.6%,CD90是71.3%,CD49d是7.8%,CD106是3.5%。从传1-5代,CD45阳性率是0.8%-9.3%,CD90是84.7%-94.8%,CD49d是16.8%-31.0%,CD106是8.3%-22.2%。各代ADSCs中,CD49d的阳性率均高于CD106。ADSCs的视紫红质的诱导效应是17.5%-46.0%,CK的诱导效应是19.7%-79.3%,S-100的诱导效应是27.3%-50.7%。结论ADSCs具有向光感受器细胞和RPE细胞分化的潜能。

自体细胞辅助脂肪注射隆乳的手术配合

由于假体隆乳手感差，取出率高，奥美定事件也给人们造成了很大伤害，作为软组织填充材料，具有生物相容性好，获取方便，来源丰富，不存在异体填充物或移植物可能引发的副作用和潜在的风险，成为目前较理想的注射充填材料。

脂肪源性干细胞无酶分离培养方法的研究

目的探索适合临床治疗应用的脂肪源性干细胞(ADSCs)分离培养方法。方法分别采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养细胞,对比分析分离的间充质干细胞特性。结果无酶分离法所需时间仅为胶原酶消化法的1/3,分离的细胞在细胞形态学、增殖能力、免疫表型、分化潜能等特性与胶原酶消化法分离培养的细胞一致。结论无酶分离法能够从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养出ADSCs,是一种安全可靠、适合临床应用的ADSCs分离培养方法。

脐血造血干/祖细胞与脂肪干细胞共培养的作用距离研究

设计了一种细胞间距可调的trans well共培养方法，以研究脐带血来源的造血干／祖细胞（HS／PCs）和人脂肪干细胞（human-adipose derived stem cells，h-ADSCs）体外共培养时细胞间作用距离对造血干细胞扩增能力和脂肪干细胞在共培养后干细胞特性的影响。采用不同规格的砂纸打磨孔板的上壁面，经高精度游标卡尺测量，使两种细胞之间的有效接触间距为10--450μm不等。然后以h-ADSCs为基质细胞，分别考察HS／PCs和h-ADSCs在不同的作用距离下的共培养情况。其间每24小时对细胞进行计数，观察细胞形态。培养7天后对MNCs表面抗原CD34＋、CFU-GM集落扩增倍数进行了检测；同时也对h．ADSCs表面抗原（CD13、CD29、CD34、CD44、CIM5、CD73、CD105、CD166、HLA-DR）及其多向分化潜能（成骨、成软骨、成脂肪）进行分析以鉴定其干细胞性能。结果表明，通过transwell共培养，细胞之间在作用距离为350gm时HS／PCs的扩增效果最好，其中造血MNCs扩增了15．1±0．2倍，CD34＋扩增了5．0±0．1倍：扩增的h-ADSCs表达CD29、CD44、CD166，而不表达CD34、CD45，且在适当诱导条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化。

脂肪间充质干细胞不同移植方法治疗扩张型心肌病兔的比较

目的观察脂肪间充质干细胞不同移植方法对扩张型心肌病兔心功能的影响。方法健康白耳兔50只腹腔注射阿霉素建立扩张型心肌病模型,并随机分为模型1组、模型2组和对照组。将体外分离培养的脂肪间充质干细胞采用心肌内多点注射法移植入模型1组病兔,采用经冠状动脉移植方法植入模型2组病兔,对照组采用心肌内多点注射法注射相同体积的IMEM培养基。术后4周处死动物留取心脏,荧光显微镜下观察脂肪间充质干细胞植入体内后的存活及分化情况。于细胞移植术前和术后4周将三组兔行超声心动、血流动力学检查,测定、比较心功能指标。结果采用两种不同移植术后,脂肪间充质干细胞均可以在病损心肌中成活,并分化为心肌细胞;移植术后4周,模型2组与模型1组心功能比较,左心室舒张末容积及左心室收缩末容积下降(P<0.05～0.01),左心室每搏输出量、心脏射血分数、左心室收缩压、左心室室内压最大上升速率和最大下降速率增加(P<0.05～0.01)。结论脂肪间充质干细胞移植后可在心肌细胞内存活,并可分化为心肌细胞,改善扩张型心肌病兔的心脏功能;经冠状动脉移植较心肌内多点注射移植法更有利于发挥间充质干细胞改善心脏整体收缩功能的功效。

脂肪干细胞分离纯化方法研究进展

脂肪干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程中,而获得足够量的、活性高的、高纯度的脂肪干细胞是其在组织工程中应用的前提。本文综述近几年来脂肪干细胞分离纯化方法的研究进展,比较各方法的优缺点,为分离纯化出理想的脂肪干细胞提供理论依据。

核心结合因子过表达定向诱导脂肪组织来源干细胞体内、外成骨

目的:探讨脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和核心结合因子(Core Binding Factor Alpha 1,Cbfa1)的成骨潜能及其应用于基因增强的骨组织工程临床治疗的可能性。方法:利用重组了Cbfa1的腺病毒载体在ADSCs中过表达Cbfa1。采用Realtime RT-PCR定量检测成骨特异性基因和成脂特异性基因的表达变化。同时采用Von Kossa染色观察Cbfa1过表达后21天ADSCs内钙盐的沉积情况。在体内实验中,裸鼠右下肢肌肉内注射Cbfa1基因修饰的脂肪来源干细胞,8周后,采用石蜡切片(HE和甲苯胺蓝染色)检测软骨和骨的生成情况。结果:Cbfa1转染后3天,ADSCs中检测到Cbfa1 RNA表达,及骨钙素、骨桥素、I型胶原表达,同时脂蛋白脂酶表达下降。Vocassa染色证明,转染Cbfa1后,ADSCs细胞基质中的钙盐沉积显著增加。体内实验8周后,注射Cbfa1基因修饰的脂肪来源干细胞的肌肉内有明显的软骨和骨组织形成。结论:Cbfa1过表达可定向诱导ADSCs体外钙盐沉积和体内成骨,可作为基因增强的骨组织工程中有潜力的治疗基因和载体细胞。

阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的作用

目的：研究阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的影响.方法：在诱导棕色脂肪干细胞向起搏特性诱导的过程中,培养基中加入经典Wnt通路阻断剂Dkk-1培养10 d.相差显微镜观察诱导组细胞的形态学变化、应用real-time PCR检测其中起搏细胞发育相关结构基因的表达情况,免疫荧光显色普通光镜和激光共聚焦显微镜观察起搏特征分子的蛋白表达.结果：分化后的棕色脂肪干细胞具有起搏细胞特性,经Dkk-1诱导后,棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的转化率明显提高,起搏细胞发育相关基因和蛋白表达明显上调.结论：阻断经典Wnt通路可促进棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的分化.

不同培养方法对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响

目的比较组织块贴壁法及胶原酶消化法所得脂肪干细胞的成骨分化能力。方法分别采用组织块贴壁法及胶原酶消化法原代培养小鼠脂肪干细胞,观察细胞形态及细胞增殖情况,并进行细胞鉴定,比较两者成骨分化能力。结果两种方法所得脂肪干细胞在形态学上无差异,培养至第3代,细胞生长状态良好,生物学特性稳定,CD44、Sca-1表达率>90%,CD31表达率<10%,具有较好的成脂、成骨分化能力;组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞增殖率高于胶原酶消化法(P<0.05);组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞矿化结节、ALP活性及钙离子浓度高于胶原酶消化法(P <0.05)。结论组织块贴壁法相对胶原酶消化法在脂肪干细胞培养及成骨诱导分化过程中更具优势。

骨组织工程中干细胞的研究与应用

背景:是否可以通过改进对已知的可以分化成骨的干细胞的培养方式或者寻找到新的干细胞,为骨组织工程找到更为合适的种子细胞。目的:从干细胞的分离培养、生物学特性及标志物等方面对各类干细胞的在骨组织工程中的应用进行综述。方法:以英文检索词为"bone tissue engineering,seed cells,stem cell,osteoblast differentiation"及中文检索词为"骨组织工程,种子细胞,干细胞,成骨分化",由第一作者检索1995年至2012年PubMed数据库及中国知网中文科技数据库,查阅近年种子细胞相关文献,最终保留50篇文献,从分离培养方法、基本特性及在骨组织工程中的应用3方面进行综述。结果与结论:文章分别对各类干细胞(包括:胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞、外周血来源的多潜能间充质干细胞、脂肪干细胞、子宫内膜基质干细胞、人羊膜基质细胞、牙髓干细胞)的分离方法、生物学特性、标志物等相关实验研究进行了探讨。目前用于分离纯化骨髓间充质干细胞的方法主要有4种:密度梯度离心法、全骨髓贴壁培养法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。研究证实各类干细胞在特定条件下均有分化成骨的能力。

脂肪干细胞与碱性成纤维细胞生长因子在颗粒脂肪移植中应用的研究进展

自体移植颗粒脂肪的成活率受到再血管化及组织细胞分化不足等问题的影响,对脂肪组织来源干细胞(ASCs)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在自体颗粒脂肪移植中应用的研究中发现,两者能明显提高自体颗粒脂肪移植后的成活率。现广泛查阅近年ASCs和bFGF在颗粒脂肪移植中作用的相关文献,并进行综合分析,探讨ASCs和bFGF在颗粒脂肪移植中的研究进展。

利福平对兔脂肪干细胞增殖、成骨及黏附支架的影响

目的探讨利福平（rifampicin，RFP）对兔脂肪干细胞（rabbitadipose-derivedstemcells，rADSCs）增殖、成骨及黏附支架的影响，为后期RFP缓释系统与rADSCs的复合奠定实验基础。方法分离培养rADSCs，检测细胞周期及表面抗原CD44，成骨、成脂诱导后分别行茜素红及油红O染色。用利福平生长液干预rADSCs，按浓度分为0、10、20及30μg／ml4组，分别绘制细胞生长曲线、检测细胞凋亡率及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）含量。制备同种异体脱钙骨支架，并复合各组rADSCs，计算细胞黏附率，扫描电子显微镜观察复合情况。结果rADSCs呈长梭形生长，G0／G1期占78．3％±4．2％，表面抗原CD44阳性表达。成骨诱导后茜素红染色及成脂诱导后油红O染色均为阳性。生长曲线示30μg／ml组第4-11天增殖能力较其他3组弱（P〈0．01），细胞凋亡示30μg／ml组凋亡率高于其他3组（P〈0．01），ALP检测示成骨诱导后第14天30μg／ml组ALP含量较其他3组少（P〈0．01），细胞黏附率示30μg／ml组较其他3组低（P〈0．01）。扫描电镜观察30μg／ml组黏附的细胞数量少，形态松散。结论不影响rADSCs增殖、成骨及黏附支架的RFP临界浓度约为20μg／ml。

改良法原代培养人脂肪间充质干细胞及其鉴定

背景:采用常规酶消化法提取人脂肪间充质干细胞,由于消化的时间过长,导致获得的细胞活性变差,为满足组织工程对种子细胞数量的需求,该实验旨在寻找一种改良的人脂肪间充质干细胞培养方法。目的:胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取人脂肪间充质干细胞并进行相关生物学特性的鉴定。方法:将脂肪组织剪碎后分别应用胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法、常规胶原酶消化法进行培养;通过锥虫蓝拒染法计数细胞,比较不同方法获取细胞的产量、活力及增殖能力;利用流式细胞仪检测改良组细胞表面抗原CD105、CD73与CD44的表达;成骨或成脂诱导后,用碱性磷酸酶染色和油红O染色鉴定细胞分化能力。结果与结论:①胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取的细胞数量远多于常规酶消化法;②胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取的人脂肪间充质干细胞增殖能力强,细胞活力好,比常规酶消化法早1 d进入平台期,传代一次需5 d左右;③第3代改良组人脂肪间充质干细胞CD105、CD73与CD44表达均呈阳性,且纯度均达93%以上;④改良法获取的人脂肪间充质干细胞有良好的成骨与成脂分化能力;⑤结果表明,胶原酶Ⅰ消化法联合组织块培养法较常规酶消化法可获得数量多、活力好、增殖能力强的人脂肪间充质干细胞,且能够稳定传代,具有良好的分化能力,这满足了组织工程学的需求。

基于细胞生物学方法比较5种不同组织来源间充质干细胞的特征

背景:间充质干细胞的来源以及分离方法越来越多样,充分认识到这些间充质干细胞的异同,将有助于间充质干细胞在临床中更加合理规范的应用。目的:比较不同组织来源间充质干细胞的生物学特征。方法:采集剖宫产产妇在生育后脱落的脐带、胎盘以及部分脂肪组织,采用胰酶消化法或组织块贴壁法培养出底蜕膜间充质干细胞、绒毛膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带胎盘连接处间充质干细胞、脐带间充质干细胞,所用的干细胞培养基有3 种:含胎牛血清的干细胞培养基、含脐血裂解物的干细胞培养基、含无血清添加物的干细胞培养基。检测不同培养条件下的细胞直径、表面标志物以及多向分化能力,检索GEO数据库分析不同间充质干细胞的基因表达情况。结果与结论:①不同培养条件影响细胞大小和细胞周期,其中无血清培养体系培养的间充质干细胞直径偏小,而脐血裂解物干细胞培养基能够增加胎盘源间充质干细胞的直径;②5 种间充质干细胞有类似的表面标志物,都具有成骨、成软骨和成脂肪分化能力,其中脂肪间充质干细胞成脂肪分化能力更强;③脂肪间充质干细胞相比于与其他4 种干细胞在基因表达上存在较大差异,具有更复杂细胞基质成分。

原代大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养扩增及鉴定

背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用。目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索。目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体。方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO2培养箱内进行原代培养。待细胞达80%-90%融合时,以1∶3的比例进行传代培养。倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验。结果与结论:(1)原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80%-90%,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;(2)流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;(3)第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;(4)由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法。

自体脂肪干细胞移植治疗2型糖尿病的安全性及有效性

目的探讨自体脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗2型糖尿病的安全性和有效性。方法培养自体ADSCs,并进行鉴定。将2型糖尿病患者48例分为2组:A组(n=24)行ADSCs移植联合常规治疗,B组(n=24)行常规治疗。随访观察15个月,分析2组患者治疗时和治疗后3、6、12、15个月的空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2h-PGh)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、空腹C肽(FC-P)、C肽曲线下面积(AUCC)、胰岛素剂量、不良反应的情况。结果培养的ADSCs符合自体临床应用标准。与治疗前相比,2组患者FPG、2h-PGh和Hb A1c都有明显降低,且A组降低更显著;A组在FC-P、AUCC和胰岛素用量方面的改善明显优于B组。在干细胞治疗过程中无明显不良反应。结论采用自体ADSCs移植可以安全有效地治疗2型糖尿病。

悬浮法及酶消化法分离培养脂肪干细胞

目的:了解脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)的获取及原代培养方法,明确体外定向分化条件,为进一步ADSCs移植实验提供基础。方法:取6周龄雄性大鼠,脱颈处死,在无菌条件下取大鼠腹股沟处脂肪组织,放入装有PBS的培养皿中,剔除肉眼可见的血管及筋膜,分别用酶消化法及悬浮组织块法培养、传代及鉴定,并比对两种方案的优缺势。结果:悬浮法和酶消化法培养得到的大鼠ADSCs形态均为梭形纤维样,生长迅速,生长曲线为典型的“S”形,两种方法获得的ADSCs经成骨诱导培养3周后茜素红染色均为阳性,成脂诱导培养3周后,油红染色也均为阳性。结论:大鼠提取的脂肪组织经两种培养方法均可定向诱导分化为ADSCs,并可稳定增殖传代,但悬浮法较酶消化法更便利,价格更低廉。

脂肪干细胞向表皮细胞表型转分化的研究

目的 探讨脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）跨胚层向表皮细胞表型转分化的可能性。方法 取大鼠脂肪组织，用酶消化法分离、培养ADSCs，用免疫细胞化学法、流式细胞仪法鉴定ADSCs。实验分为皮肤匀浆条件培养基诱导7d组；皮肤匀浆条件培养基加入EGF（20ng/ml）诱导7d组；皮肤匀浆条件培养基诱导4d，撤条件培养基，改10％FBS／DMEM培养3d组；10％FBS／DMEM为对照组。诱导后经流式细胞仪检测CK19、CK10的表达。结果 ①免疫细胞化学分析表明ADSCs表达CD49d。而不表达CD106、CD34、CK19、CK10；流式细胞仪检测CD49d、CD44的阳性率分别为94．32％、90．38％。②各诱导实验组细胞CK19阳性率分别为45．32％、26．58％、23．37％，CK10阳性率分别为43．56％、25．54％、18．20％，较对照组CK19阳性率18．53％、CK10阳性率2．46％，明显增高（P〈0．01），差异有统计学意义。结论 皮肤匀浆液可以诱导ADSCs向表皮细胞表型转分化。