花生AhFAD2作为选择标记构建含油量遗传群体

有性杂交是花生(Arachis hypogaea L.)育种的重要途径,真杂种鉴定对于遗传群体的构建以及新品种选育至关重要。花生含油量的表型鉴定极易受到环境条件的影响,且目前缺少可用的分子标记。本研究选用高油及普通油酸亲本宇花14号与低油及高油酸亲本LOP215杂交构建含油量相关遗传群体。宇花14号含有AhFAD2A及AhFAD2B位点,基因型为AABB,LOP215含有AhFAD2a及AhFAD2b位点,基因型为aabb。以宇花14号为母本、LOP215为父本杂交,收获F_(1)杂交籽仁,采用竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)检测AhFAD2基因型,剔除AhFAD2基因型为纯合的籽仁,选留FAD2基因型为杂合的F_(1)真杂种。F_(1)真杂种单粒播种收获后,单株检测含油量,对于F_(2)表型无明显分离的株系,取各单株叶片等量混合后提取DNA,进行AhFAD2基因型检测再次确认AhFAD2位点的杂合性。经二次验证后的F_(2)籽粒经连续自交6代后选育出包含460个家系的重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)群体,其含油量呈连续正态分布,可作为含油量基因定位的有效分离群体。本试验以AhFAD2作为选择标记能简单高效地筛选出真杂种,构建目标性状分离群体,为花生含油量基因定位及高低油花生品种选育提供材料。

ahFAD2A等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分析

在中国小核心花生种质中发掘出油酰PC脱氢酶的2个等位基因(ahFAD2A-wt和ahFAD2A-m)。研究结果表明:(1)突变型等位基因(ahFAD2A-m)与野生型等位基因(ahFAD2A-wt)在编码区442bp的SNP(448bpG>A)可导致编码氨基酸的替换(D150N);(2)突变型基因ahFAD2A-m在中国花生小核心种质中广泛存在,出现的频率为53.1%,野生型基因ahFAD2A-wt出现的频率为46.9%;(3)突变型基因ahFAD2A-m在密枝亚种(普通型和龙生型变种)中出现的频率(82.8%)显著高于其在疏枝亚种(珍珠豆型和多粒型变种)材料中出现的频率(15.4%),卡方测验结果表明,核心种质的油酸含量与其携带的等位基因类型密切相关(χ2=98.71,χ20.01,3=11.34,P<0.01),携带突变型基因(ahFAD2A-m)材料的油酸平均值显著高于野生型基因的材料(t=18.48>t0.01=2.62,P<0.01);(4)ahFAD2A等位基因的存在与种子油酸含量密切相关。

花生ahFAD2A等位基因表达变异与种子油酸积累关系

花生ahFAD2A是控制种子油酸、亚油酸含量和油亚比的关键基因。利用ahFAD2A基因特异引物检测远杂9102、豫花9416等52个花生品种的ahFAD2A基因等位变异,并比较其中13个品种的ahFAD2A基因序列。结果表明,花生ahFAD2A基因存在G-A两种单核苷酸等位变异(野生型ahFAD2A-wt和突变体ahFAD2A-m)。DNA序列比对结果证实,豫花9416等10个品种(突变体)与远杂9102、延津花籽和开农白2号(野生型)相比,在ahFAD2A基因的448bp处存在核苷酸G-A突变。应用real-timePCR检测ahFAD2A等位基因在种子不同发育时期的表达动态显示,突变体豫花9416等位基因(ahFAD2A-m)在种子发育中期表达量稍高,种子发育后期表达量下降速度较野生型远杂9102(ahFAD2A-wt)更快。进一步测定豫花9416和远杂9102在种子不同发育时期的油酸、亚油酸积累和油亚比动态,发现2个品种间存在明显差异,豫花9416在籽粒发育前期油酸相对含量已超过亚油酸,油亚比大于1并逐渐增加,而远杂9102到籽粒发育中后期油酸相对含量才高于亚油酸,油亚比逐渐接近于1左右。

ahFAD2基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化

将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段。利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛。

花生AhFAD2-1基因与油酸/亚油酸比值的关系

花生AhFAD2-1由位于不同基因组上的两个非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同编码,这两个基因的突变引起酶结构、酶活性或表达调控的变化,共同导致高油酸性状的产生。本研究通过对13个不同花生品种（系）的AhFAD2-1基因进行测序和比对分析,查找点突变或插入位点,寻找与高油酸性状关联的基因位点。结果表明：E11、花育30、鲁花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2,其相应的O/L值为1.01-1.40;鲁花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2,其中E12S较特殊O/L值为9.05,其他品种O/L值为1.54-1.97;E16、E18和花育32号的基因型是ol1ol1ol2ol2,其相应O/L值为12.3-41.85。本研究结果对于高油酸性状的分子鉴定以及高油酸花生新品种的培育具有一定的参考价值。

花生杂种分子鉴定和ahFAD2基因分型技术研究进展

杂种真实性鉴定是花生杂交育种及遗传学研究的重要环节。本研究综述了花生杂种F1真实性鉴定的分子标记方法,详述了控制花生高油酸性状(F435型)的ah FAD2基因的检测方法及其在杂种鉴定和高油酸育种中的应用。

花生AhFAD2-2基因的克隆与表达分析

脂肪酸脱氢酶(FAD)能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示,2个基因的ORF区均为1 152 bp,编码383个氨基酸;c DNA水平上有12个碱基差异位点,其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变;它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp,在5'UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示,这两个基因为组成型表达,其中在叶片中的表达量最高,花和根中次之,茎与种子中表达量最低。低温处理下,幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加,至12 h达最高值,随后表达量逐渐下降,说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。

ahFAD2基因在江苏地方花生品种中的分布及其与油酸含量的相关性分析

【目的】为了阐明ahFAD2基因的遗传规律及其与种子油酸含量的关系,探究油酸含量与主要性状的相关性。【方法】利用CAPS标记对141份江苏地方品种的ahFAD2基因位点进行检测。【结果】25份材料ahFAD2A位点为野生型,116份材料ahFAD2A位点符合448G>A的突变类型,ahFAD2B基因只存在野生位点;突变型位点所占的比率在交替亚种中远高于连续亚种;油酸含量均值在具有突变型位点花生中显著高于具有野生型位点花生;花生油酸含量与亚油酸含量有极显著的负相关关系。【结论】本研究认为ahFAD2A等位基因位点与花生种子油酸含量有极显著的相关关系;普通型花生中含有较多的中等油酸含量的ahFAD2A-m。

花生AhFAD2的基因型与O/L值的相关性分析

花生(Arachis hypogaea L.)高油酸性状受2对同源非等位隐性基因ol1和ol2调控,分别编码Ah FAD2A和Ah FAD2B。本研究利用红外无损检测技术分析不同花生品种的油酸、亚油酸及粗脂肪含量,并设计等位基因特异引物,对不同油亚比值的12个花生品种进行AS-PCR检测分析。结果表明:对12个花生基因型均能准确分析出Ah FAD2基因型,其中1514、606、9102、614和1474的基因型为OL1OL1OL2OL2,其相应的O/L值位于0.971~1.759;花17、1513、1476和1586的基因型是ol1ol1/OL2OL2,其相应的O/L值位于2.252~3.679;1504、1505和1515的基因型为ol1ol1ol2ol2,其相应的O/L值位于8.204~12.79。综合12个花生品系籽粒O/L值和Ah FAD2基因型的相关性结果表明,基因型的改变直接导致O/L值的变化,但与含油量无特定相关性。

16份花生品种(系)油酸含量及FAD2基因型鉴定

为研究花生油酸含量与AhFAD2基因型的关系,选用低(小于50%)、中(50%~70%)、高油酸(大于75%)含量的16个品种(系)进行分析。通过竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)和直接测序法对AhFAD2进行分型,结果表明低油酸品种(系)的基因型均为AABB,中油酸品种(系)的基因型为aaBB,高油酸品种(系)的基因型为aabb。7个高油酸品种(系)的AhFAD2B突变为F435突变,即442位A碱基插入,而06B16的AhFAD2B突变为665位205 bp MITE转座子的插入。对16个花生品种(系)控制油酸基因型的鉴定,尤其是高油酸种质06B16基因型的确定将为高油酸花生分子育种提供理论参考。