草鱼芳香烃受体ahr1a基因克隆、表达及进化分析

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的功能调节方面扮演重要角色,炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼(Ctenopharyngodon idella)ahr1a基因在炎症发生过程中的作用,本研究克隆获得了草鱼ahr1a基因cDNA序列,全长2893 bp,其编码区共2544 bp,编码847个氨基酸。结构域预测发现草鱼AhR1a蛋白含有螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)超家族中bHLH-PAS(Period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single minded,Pre-Arnt-Sim)亚家族的典型结构域。氨基酸序列分析表明,草鱼AhR1a与黄河鲤(Cyprinus carpio)的相似性与一致性最高。系统进化树结果发现草鱼ahr1a基因与金鱼(Carassius auratus)、黄河鲤和斑马鱼(Danio rerio)的同源基因聚在一支。草鱼ahr1a基因在多个组织(肠、鳃、肾、肝、头肾、胸腺、脾、皮肤、脑)中均有表达,其中肠和鳃表达量最高。草鱼感染柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)后,ahr1a在脾(24、48 h)和头肾(12、24 h)中的表达水平显著下降。腹腔注射草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of grass carp,GCRV)后,脾和头肾中ahr1a表达水平无明显变化。体外实验结果显示,脂多糖(Lipopolysaccride,LPS)和IL-1β重组蛋白下调草鱼原代头肾白细胞中ahr1a的表达。综上所述,本研究克隆分析了草鱼ahr1a基因并初步证实其参与炎症反应的调控。

某市嘉陵江水中提取物对大鼠肝细胞AHR信号途径的诱导

目的研究某市主城区嘉陵江水中有机污染物对大鼠肝细胞细胞色素P450 1A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)基因表达和7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮.脱乙基酶(7-ethoxyresorufin-O-deethylase,EROD)活力的诱导,比较不同剂量的有机提取物诱导大鼠肝细胞CYP1A1基因表达量和EROD酶活力的变化。方法将大鼠分为2、12和72 L/(kg体重)3个染毒组及1个玉米油溶剂对照组和1个空白对照组,每组20只动物,雌雄各半,灌胃染毒13周。染毒结束,提取大鼠肝细胞总RNA进行CYP1A1基因的RT-PCR扩增,将肝组织匀浆后测定其EROD酶活力。结果各染毒剂量组CYP1A1基因均有表达,空白对照和溶剂对照组CYP1A1基因不表达;中剂量组与高剂量组CYP1A1的相对表达量与低计量组相比,增加非常显著(P<0.01),各染毒组大鼠肝组织均可检出EROD酶活力,EROD酶活力随染毒剂量的增加而增加。结论嘉陵江水中有机污染物可诱导大鼠肝细胞芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)途径。

基于AhR/ARNT/NQO1信号通路探索青蒿琥酯对类风湿关节炎骨破坏的抑制作用

基于芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)/芳香烃受体核转位因子(AhR nucleart ranslocator,ARNT)/醌氧化还原酶NADH 1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]信号通路探索青蒿琥酯(artesunate,ARS)抗类风湿关节炎骨破坏作用。采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)和核因子-κB受体激活剂(receptor activator of nuclear factor-κB,RANKL)诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的模型,给予ARS(0.2、0.4、0.8μmol·L^(-1))干预后,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色和F-actin染色来观察破骨细胞的形成和分化,Western blot法检测细胞中AhR和NQO1蛋白表达,免疫荧光定位观察破骨细胞中AhR和ARNT表达分布。同时,建立牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型,并给予ARS(7.5、15、30 mg·kg^(-1))干预,Masson染色观察CIA大鼠软骨和骨破坏情况,免疫组织化学法观察大鼠膝关节组织中AhR、ARNT表达,Western blot法检测膝关节组织中NQO1蛋白表达。结果显示,RANKL诱导组可见大量的TRAP阳性细胞。与RANKL诱导组相比,ARS(0.2、0.4、0.8μmol·L^(-1))可以剂量依赖性地抑制TRAP阳性细胞数目;F-actin染色结果显示,随着ARS剂量的升高,对F-actin形成的抑制作用显著增强;Western blot实验和免疫荧光实验进一步发现,ARS干预以后可明显促进AhR表达,且同时向核内转移,进而激活下游ARNT和抗氧化酶NQO1蛋白表达。同时,成功建立CIA大鼠模型,Masson染色实验结果显示,模型组大鼠的关节骨破坏严重,表现为表层软骨失染,胶原纤维排列紊乱,软骨和骨边界不清晰,而阳性药物和ARS不同剂量均对软骨和骨破坏有不同程度的改善作用,尤其是ARS高剂量组作用效果最显著;免疫组织化学法发现ARS不仅促进CIA大鼠膝关节软骨和骨中AhR与ARNT蛋白表达,还可以促进大鼠膝关节组织NQO1蛋白表达。综上,ARS可能通过激活AhR/ARNT/NQO1信号通路,抑制破骨细胞分化从而改善类风湿关节炎。