Separation and Screening of Biocontrol Actinomyces against Alfalfa Root Rot

[Objective] Actinomycetes with high antagonistic effects on alfalfa root rot pathogen was isolated from 10 soil samples in Chifeng Inner Mongolia. [Method] 91 actinomyces were separated from 10 soil samples in Chifeng Inner Mongolia by gradient dilution separation method. In duel culture tests, all isolates were tested for their antagonism by using 3 strains including Fusarium solani, F. oxysoporum, F. avenaceum of alfalfa root rot pathogenic bacteria as indicator strains. [Result] 5 strains with strong antagonistic effect on tested alfalfa root rot pathogen were obtained from No.1, No.4, No.6 and No.7 soil samples which were numbered 1-3-6, 4-4-2, 6-2-27 and 7-2-13 respectively, accounted for 5.50% in separated strains. [Conclusion] This study laid certain foundation for biological control of alfalfa root rot disease.

新型苜蓿镰刀菌根腐病病原菌FIESC分离及菌株生物学特性测定

为明确北京市顺义区苜蓿(Medicago sativa L.)镰刀菌根腐病的病原菌种类,本研究采用常规组织分离法对发病苜蓿样品进行病原菌分离纯化;利用形态学特征观察结合多基因序列分析(rDNA-ITS,EF-1α和RPB2)的系统发育树对病原菌进行鉴定,并按照柯赫法则测定菌株致病性;采用菌丝生长速率法,测定强致病镰刀菌的生物学特性及杀菌剂的抑制作用。结果表明,本研究共分离获得26株菌株,7株鉴定为镰刀菌,分别属于Fusarium incarnatum-equiseti species complex(FIESC)中的F.ipomoeae,F.compactum和F.flagelliforme以及锐顶镰刀菌F.acuminatum和腐皮镰刀菌F.solani,其中MsF1(F.ipomoeae)的致病力最强,接种苜蓿幼苗发病的病情指数为64.33。生物学特性测定表明,MsF1在温度30℃、pH值为6~10、低氮条件下最适合生长,可耐受150 g·L^(-1)的NaCl胁迫;异菌脲对其抑制效果不明显,供试浓度下抑制率低于10%,而咯菌腈对其半数效应浓度(Median effect concentration,EC 50)为0.142μg·m·L^(-1)。本研究首次报道FIESC可侵染紫花苜蓿引起镰刀菌根腐病,为苜蓿根腐病的多样性研究和田间有效防治提供科学依据和理论支撑。

内蒙古自治区紫花苜蓿根腐病病原菌鉴定

为明确内蒙古自治区紫花苜蓿根腐病的主要病原菌种类,从内蒙古自治区5市12个样点采集紫花苜蓿根腐病病样,采用常规组织分离法对病原菌进行分离与纯化,利用形态学结合ITS和EF-1α基因序列鉴定分离物种类,按照柯赫氏法则测定其致病性。结果显示,5市12个样点共分离出425株真菌,按照菌株的菌落和分生孢子形态,结合基因序列鉴定为5属17种,分别为锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)、茄病镰刀菌(F. solani)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、变红镰刀菌(F. incarnatum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、燕麦镰刀菌(F. avenaceum)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)、层出镰刀菌(F. proliferatum)、F. falciforme、F. neocosmosporiellum、三线镰刀菌(F. tricinctum)、F.virguliforme、芬芳镰刀菌(F.redolens)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、织球壳枯萎菌(Plectosphaerella cucumerina)、茎点霉(Phoma medicaginis)和根异茎点霉(Paraphoma radicina),其中轮枝镰刀菌、F. falciforme、F.neocosmosporiellum和F. virguliforme引发苜蓿根腐病在世界范围内首次报道。致病性测定表明,17种真菌均能够引起紫花苜蓿根腐病。紫花苜蓿根腐病可由单一病原菌或2~4种病原菌复合侵染引起,且不同地区的致病种群结构不同,但优势致病种均为锐顶镰刀菌。

不同紫花苜蓿品种对异茎点霉根腐病的抗病性评价

紫花苜蓿异茎点霉根腐病(alfalfa Paraphoma root rot,APRR)是本研究团队发现并报道的一种世界新病害。为探究不同苜蓿品种对异茎点霉根腐病的抗病性,本研究通过蘸根接种,在测定国内外30个不同苜蓿品种接种根异茎点霉后各植株的发病率、病情指数、株高、根长、单株地上生物量和单株地下生物量等指标的基础上,采用隶属函数标准差系数赋予权重法对其抗病性进行了综合评价。D值为各品种综合评价值,D值越大,该品种抗病性越强,反之越弱。结果显示:龙威3010、巨能2号和甘农3号的综合评价值D值均>0.9,分别为0.972、0.955和0.916,表明上述3个苜蓿品种对异茎点霉根腐病(APRR)的抗性较强;而草原3号和公农1号的D值<0.2,分别为0.003和0.113,对该病的抗性差;其他品种抗病性居中。研究结果初步筛选出3个对APRR抗病性强的品种,为紫花苜蓿的生产和异茎点霉根腐病的防治提供了理论依据。

苜蓿根腐病生防真菌筛选鉴定及其防治效果研究

根腐病是苜蓿(Medicago sativa)生产中的重要限制性病害,应用生物技术对其进行防治对环境友好型可持续农业具有重要意义。本研究从不同地区苜蓿根际土壤中分离得到的95株真菌中筛选出了2株对根腐病病原菌抑菌率较高的菌株,经鉴定,2株拮抗真菌ZY56和GY37分别为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和康宁木霉(Trichoderma koningii)。对2株菌株的拮抗能力及盆栽防效的测定结果表明:2株菌株对4种镰刀菌(Fusarium spp.)均有较好的抑制效果,其7 d抑菌率在54.9%~75.3%之间,其中ZY56对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和半裸镰刀菌(F.semitectum)的抑菌率较高,而GY37对燕麦镰刀菌(F.avenaceum)和腐皮镰刀菌(F.solani)的抑菌效果更好;ZY56对盆栽苜蓿根腐病的防效显著高于多菌灵,达到66.4%,且促进生根效果明显,GY37也具有良好的防治效果,防效为55.1%。

苜蓿根腐病病原菌分离鉴定与抗病种质材料筛选

在黑龙江省大庆市采集具有典型苜蓿根腐病症状的发病植株进行病原分离、纯化,根据形态学和rDNA-ITS序列分析进行鉴定,确定分离获得的苜蓿根腐病病原菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。对来自国内外具有较强抗寒性的16个紫花苜蓿品种芽期接种病原菌菌株,于接种后第14d测定紫花苜蓿幼芽的相对根长、相对苗长和病情指数,利用隶属函数值对不同品种苜蓿进行抗病性综合评价。结果表明,层出镰刀菌接种后,各紫花苜蓿品种幼芽的相对根长、相对苗长及病情指数差异显著(P<0.05);根据隶属函数值评价结果,品种WL168HQ、TG4、斯贝德和肇东的综合抗病性表现较强,DS310FY、北极星、皇后、WL319HQ和巨能-CR的综合抗病性较弱。

苜蓿根腐病多种病原菌的分子检测

【目的】研究苜蓿根腐病病原菌种类和各种病原菌在病株中的出现频率,以及单一病株受到多种病原菌复合侵染的情况,并为该病复合侵染规律及防治奠定基础。【方法】利用已报道的7种病原菌的7对特异性引物,分别对新疆北疆主要苜蓿种植区采集的根腐病混合病样,及单一重病田分单株采集的根腐病病样进行PCR检测。【结果】新疆北疆主要苜蓿种植区根腐病病样中可检出的根腐病病原种类主要有5种镰刀菌和1种丝核菌;其中,立枯丝核菌、木贼镰刀菌、锐顶镰刀菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌5种病原菌在病株样品中普遍存在,是新疆北疆部分地区苜蓿根腐的主要病原菌;侵染根部的病原菌中以尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌和立枯丝核菌为优势种群,侵染茎基部病原菌中以茄腐镰刀菌和木贼镰刀菌为优势种群。检测结果还表明苜蓿根腐病病样中两种及两种以上病原菌复合侵染的的比率达到83%。【结论】木贼镰刀菌、锐顶镰刀菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌是新疆北疆部分地区苜蓿根腐病的主要病原菌,拟知孢镰刀菌是出现频率较低的次要病原菌;根部病斑与茎基部病斑中优势病原菌种类有所不同;田间病株中多病原复合侵染的情况非常普遍。

尖孢镰刀菌的分离鉴定及不同苜蓿品种芽期抗病性

为了解黑龙江省大庆市苜蓿根腐病的病原,评价不同苜蓿品种芽期对根腐病的抗病性,于2018年采集疑似感染根腐病的苜蓿病株,对其进行了病原分离与鉴定。将鉴定得到的致病菌接种于18个品种的紫花苜蓿幼芽,测定相对根长、相对苗长、发病率和病情指数,利用隶属函数进行抗病性综合评价。形态学和rDNA-ITS序列分析结果表明,分离获得的致病菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum,其对不同苜蓿品种芽期相对根长、相对苗长、发病率和病情指数均有显著影响(P<0.05)。说明尖孢镰刀菌对苜蓿有较强致病性。抗病性综合评价表明:不同苜蓿品种芽期对尖孢镰刀菌根腐病抗性由强到弱依次为:‘龙牧801’>‘斯贝德’>‘SK3010’>‘巨能-CR’>‘肇东’>‘DS310FY’>‘WL168HQ’>‘WL354HQ’>‘TG4’>‘WL319HQ’>‘擎天柱’>‘WL298HQ’>‘龙牧806’>‘北极星’>‘皇后’>‘北极熊’>‘CW2000’>‘敖汉’。

紫花苜蓿根腐病研究进展

紫花苜蓿是全世界最重要的豆科牧草,被誉为“牧草之王”,但苜蓿根腐病成为紫花苜蓿大面积推广的一个主要的限制因素。苜蓿根腐病的病原主要是镰刀菌,其中的尖孢镰刀菌、茄镰刀菌、燕麦镰刀菌等被认为是侵染根部的真菌中的优势种。生物技术是当前植物抗根腐病育种中的一个应用热点,它具有目的性强、育种效率高等优点,越来越受到人们的重视。

苜蓿根和根颈腐烂病病原及防治研究进展

综述了国内外苜蓿Medicago sativa 根和根颈腐烂病的病原研究、品种抗病性鉴定及其防治方法的研究进展,为该病害的进一步研究提供理论依据。

紫花苜蓿根腐性病害生防放线菌的分离与筛选

[目的]分离筛选出对苜蓿根腐病病原具有高拮抗作用的生防放线菌。[方法]利用梯度稀释分离法从来自内蒙古赤峰地区的10个土样中分离得到91株放线菌。以3株苜蓿根腐病菌为靶标菌,采用平皿对峙培养法,对分得菌株进行皿内拮抗作用测定。[结果]获得5株对供试苜蓿根腐病菌有较强抑制作用的拮抗菌株,编号为1-3-6、4-4-2、6-2-25、6-2-27、7-2-13,分别来自1号、4号、6号及7号土样,占分离菌株的5.50%。[结论]该研究可为苜蓿根腐病生物防治奠定一定基础。

三种镰孢菌对不同苜蓿品种致病性的比较研究

为了进一步了解根腐病病原菌的生物学特性以及不同病原菌对苜蓿的致病性,本研究以苜蓿根腐病病原BF1(Fusarium equiseti)、BF28(F.oxysporum)、BF36-2(F.solani)三种镰孢菌菌株为试验材料,观测菌落的外观特征与产孢量,并对WL343、金皇后、阿尔冈金、WL525四个苜蓿品种以菌液和菌饼两种方式接种,比较不同菌株对苜蓿的致病性。结果表明,菌液接种方式,苜蓿感病较快,感病程度较重。不同菌株在苜蓿根系的定植能力不同,BF1菌丝在根系附近聚集;而BF28及BF36-2菌丝则均匀分布于培养基表面。菌饼接种方式,不同菌株对苜蓿的致病性存在较大差异,产孢能力强的菌株致病力强。BF28对苜蓿的致病性最强,BF36-2次之,而BF1的致病性较弱。通过对感病植株进行解剖构造与致病过程观察,病菌以厚垣孢子入侵根系及叶片表皮细胞,以菌丝体及孢子形式在细胞间隙扩展,并向植物组织中释放细胞壁溶解物质,植物细胞壁溶解,根髓部腐烂中空,根颈部缢缩,叶部出现溃烂斑,植株的生长受阻。

两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究

从紫花苜蓿根际土中分离出2株芽孢杆菌(Bacillus spp.)菌株CYY-6和CYY-42,并评价了其对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用,及其对由尖孢镰刀菌引起的苜蓿根腐病的防治效果。经过形态观察、16SrDNA序列分析和生理生化鉴定,确定菌株CYY-6为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),CYY-42为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。同时检测发现这2株芽孢杆菌均能不同程度地合成嗜铁素。在平板对峙实验中,2株菌株均能对尖孢镰刀菌产生拮抗作用,并产生抑菌带,抑菌率分别为49.3%和56.3%。且其发酵液可以致使尖孢镰刀菌菌丝及孢子生长异常,出现菌丝扭曲、断裂、破碎,孢子数量明显减少等现象。在盆栽实验中,2株菌株对由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相对防效分别为57.55%和64.03%,在紫花苜蓿根腐病防治方面具有较好的应用潜力。

腐皮镰刀菌病原致病性及苜蓿品种抗病性研究

为了探明腐皮镰刀菌对紫花苜蓿种苗的致病性,本研究采用常规组织分离法从苜蓿根部分离纯化真菌,对分离得到的菌株进行形态学结合分子生物学的鉴定,并以菌饼放置种子的方法,分别以水琼脂培养基(water agar,WA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)对22个紫花苜蓿品种的种子进行试验,在14 d测定相对根长、相对苗长、相对根苗长度比、相对发芽率和病情指数,并通过隶属函数综合各个指标,对22个苜蓿品种的抗病性进行评价。结果表明:腐皮镰刀菌为导致苜蓿根腐病的病原真菌;在两种培养基质上,腐皮镰刀菌对22个苜蓿品种均有致病性,且在PDA培养基上的致病性强于WA培养基;参试的22个苜蓿品种之间抗病性有所差异,塔苜5S的抗病性最强,中苜1号、Bara310SC、乐寒F3和金皇后的抗病性较强,中兰2号、赛迪7、龙牧803和甘农3号的抗病性较弱,Paola的抗病性最弱。

苜蓿根部病害及其防治研究进展

苜蓿是高产优质的多年生豆科牧草,广泛应用于畜牧业。苜蓿根部病害尤其是苜蓿根腐病是限制苜蓿种植产业发展的重要因素。苜蓿根部病害的发生导致苜蓿产量减少、品质降低。通过总结国内外对苜蓿根部病害的相关研究,对苜蓿根部病害的分类、病原种类及病害特征、症状与危害、病害发生规律和防治措施进行了综述,重点阐述了苜蓿根部病害病原研究现状,明确了苜蓿根部病害对苜蓿产业的危害,指出了苜蓿根部病害未来的研究方向,以期为苜蓿根部病害发生机制与防治的进一步研究提供参考。

48个苜蓿品种对3种病害抗性的初步评价

在兰州大学榆中校区品种比较试验田,以发病率为指标,采用国际上通用的苜蓿病害抗病性评价的分级标准,比较了国内外48个苜蓿品种对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病的抗病性,并对其进行了综合评价。抗病性等级评价结果表明,不同苜蓿品种对褐斑病的抗性表现是UC-1465为高抗(HR)品种,UC-1887为抗病(R)品种,Siriver与Trifecta为中抗(MR)品种,Avrora、HunterRiver、SaranacAR为低抗(LR)品种,其余41个品种均为感病(S)品种;对霜霉病的抗性表现是48个苜蓿品种均为高抗(HR)品种;对锐顶镰刀菌根腐病的抗性表现是48个苜蓿品种均为高抗(HR)品种。综合评价结果表明,Vertus、中兰1号和新牧1号对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病均具有较强的抗病性,为高抗品种;UC-1887、UC-1465和SaranacAR对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病的抗病性均较差,为感病品种。

紫花苜蓿根腐病原——厚垣镰刀菌的鉴定及其拮抗菌的筛选

采用常规组织分离法,对甘肃省武威市紫花苜蓿根腐病菌进行分离和致病性测定,并通过形态学特征和分子鉴定方法对致病性最强的菌株进行鉴定。结果表明,MXGF7可造成紫花苜蓿严重根腐,该病原菌大型分生孢子多纺锤形或镰刀形,大小为3.3～4.7μm×14.8～32.0μm;小型分生孢子少,纺锤形或哑铃形,大小2.9～4.2μm×8.4～18.2μm;ITS序列及镰孢菌Fu3/Fu4区基因序列分析表明,病原菌均与Fusarium chlamydosporum的相似度达99%,结合形态学特征将该病原菌鉴定为厚垣镰孢菌F.chlamydosporum。采用平板对峙法,从分离自东祁连山高寒草地牧草的123株内生细菌中筛选出61株菌株对F.chlamydosporum有拮抗效果,且抑菌率均在55%,并利用形态特征和16SrDNA基因序列分析将具有稳定拮抗作用265ZY3菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens。

紫花苜蓿根腐病生防菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

【目的】筛选获得对紫花苜蓿根腐病病原菌具有拮抗作用的菌株,并对其发酵条件进行优化,为紫花苜蓿根腐病生物防治提供菌株资源。【方法】以青藏高原的紫花苜蓿根际土壤为研究对象,以紫花苜蓿根腐病5种病原菌为靶标,利用稀释涂布法分离细菌;利用平板对峙法筛选对苜蓿根腐病病原菌具有拮抗作用的菌株;利用平板对峙法和菌丝生长速率法测定拮抗菌株对5种苜蓿根腐病病原菌的抑菌活性;通过形态学观察、生理生化测定和16S r DNA序列分析确定拮抗菌株的分类地位;利用单因素试验和正交试验对拮抗菌株发酵条件进行优化。【结果】从紫花苜蓿根际土壤中共分离纯化出92株细菌,从中筛选出16株对供试病原菌具有较强拮抗作用的菌株,其中菌株LJ3-1的抑菌效果最强,且具有广谱抑菌活性。对菌株LJ3-1发酵滤液的抑菌活性测定结果显示,其发酵滤液对供试病原菌的抑制率为44.9%~77.4%。结合菌落形态特征、生理生化测定和16S rDNA序列分析结果,将菌株LJ3-1鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对菌株LJ3-1的发酵条件优化结果显示,其最适发酵培养基组分为3%葡萄糖、1%酵母浸粉和0.5%NaCl;最适发酵条件为初始pH 6.5~7.0、培养温度35℃、250 mL锥形瓶装液量80 mL、接种量3%、培养时间36 h、转速180 r/min。在优化后的发酵培养条件下,菌株LJ3-1对燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)的抑菌活性由76.5%提高至89.3%。【结论】菌株LJ3-1对紫花苜蓿根腐病5种病原菌均具有良好的拮抗作用,可作为研制苜蓿根腐病生物防治菌剂的候选菌株。

尖孢镰刀菌生物学特性及杀菌剂毒力测定

为了明确苜蓿根腐病致病菌尖孢镰刀菌的生物学特性和最佳杀菌剂,本试验采用不同培养基、温度、pH、光照和碳氮源的条件培养尖孢镰刀菌,测定菌落生长速率和孢子萌发率;用4种杀菌剂与PDA培养基混合制成含药培养基培养尖孢镰刀菌,测定菌落生长速率和抑制率。结果表明:适宜培养尖孢镰刀菌培养基有PSA、SNA和YMM;适宜生长温度为20~30℃、pH为7~8;黑暗条件适于生长。其中菌丝生长和孢子萌发的最适温度分别为25℃和20℃,最适pH分别为7和5,最适碳源分别为可溶性淀粉和麦芽糖,最适氮源分别为尿素和蛋白胨,菌丝和孢子的致死温度分别为52℃(10min)和50℃(10min)。在供试的4种杀菌剂中,75%百菌清抑制效果最好,在稀释500倍时抑制率为89%,EC50为4.5279mg/L。

紫花苜蓿根腐新病原-厚垣镰孢菌生物学特性研究

针对紫花苜蓿根腐致病菌厚垣镰孢菌（Fusarium chlamydosporum）在不同温度、光照、p H和多种碳氮源条件下的生物学特性,采用菌饼法进行了测定,并对不同碳氮源下菌落产色素情况进行了连续观察。结果表明：该病原菌在5~40℃均可生长,最适温度为25℃;当p H 4.0~12.0时均能生长,最适宜p H为7.0;全黑暗条件有利于菌丝生长,菌丝生长最适碳源、氮源分别为山梨醇和蛋白胨,碳源氯醛糖及除蛋白胨以外8种氮源均不利于菌丝的生长。含不同碳氮源培养基可诱导菌丝产生不同色素,且颜色变化差异大,在不同的生长阶段,色素颜色也会发生变化。