蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线虫活性研究

【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用杀线能力显著增强,24 h便达到66.32%的杀线率,72 h杀线率达到91.01%。【结论】ATP-α与ClpX经原核表达及纯化后具有较高的杀线活性,且两者共同处理松材线虫,杀线效果更强,证明蛋白酶ATP-α与ClpX是重要的杀线因子,为设计和筛选杀线药物提供了新的线索和依据。

蜡样芽孢杆菌W-3木聚糖酶xynA基因原核表达及其酶学性质研究

【目的】克隆蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)W-3菌株的木聚糖酶基因xynA并进行生物信息学分析,探究其异源表达及酶学特性。【方法】采用同源扩增法克隆xynA基因,构建原核表达载体pCola-xynA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行异源表达,通过镍柱亲和层析分离纯化并通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白,利用在线软件对xynA蛋白进行生物信息学分析。以榉木木聚糖为底物探究xynA在不同温度、不同pH条件下的酶学性质。【结果】xynA基因全长642 bp,含1个完整的开放阅读框,编码213个氨基酸。序列比对结果显示,xynA和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)亚种FZB42木聚糖酶(AJD80562.1)相似性为96%,和类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)NBRC15307木聚糖酶(AAZ17386.1)及高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)同家族木聚糖酶(WP-007407578.1)相似性为94%。xynA蛋白N-端含1个信号肽,理论等电点为9.42,分子质量为23.3 ku,蛋白结构稳定,为亲水性蛋白;存在5个潜在的糖基化位点、38个磷酸化位点,属于糖苷水解酶11家族。xynA酶活性为733.826 U/mg,其最适温度为70℃,最适pH为9.0。在60~80℃、pH 8.0~11.0时均具有较好的稳定性,80℃保温1 h可保留50.3%酶活,70℃和pH 9.0条件下保温1 h仍保留94.63%酶活。【结论】本研究成功从天然微生物蜡样芽孢杆菌W-3菌株中克隆木聚糖酶xynA基因,其编码蛋白为稳定的亲水蛋白,属于糖苷水解酶11家族。xynA表现出耐热、耐碱、高酶活特性,对温度、pH适应范围较广。研究结果为xynA开发利用奠定理论基础。

褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

作者从蜡样芽孢杆菌F1-5-10中提取DNA,通过PCR克隆得到褐藻胶裂解酶基因后,将其构建到pET-30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的褐藻胶裂解酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明:PCR扩增出1035bp大小的褐藻胶裂解酶基因algl(GenBank登录号:GU585575),SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为45 000的特异性蛋白质条带。表达条件优化实验结果表明0.4mmol/L浓度的IPTG 32℃诱导4h重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白质质量的36%。测定褐藻胶裂解酶酶活性,酶活力为11.7U/mg。酶学性质研究表明:ALGL的酶活最适温度为35℃,热稳定性较差,最适pH值为6.6,Ca2+、Mg2对酶活有激活作用,ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89mg/mL,Vmax为15.01U/mL。

蜡样芽胞杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达

采用PCR技术 ,从蜡样芽胞杆菌M2 2基因组DNA扩增到长 132 0bp的基因片段 .该片段含编码 179个氨基酸残基的开放阅读框 ,推定蛋白序列与报道的BacillusanthracisCu ,Zn SOD序列有96 %同源性 ,其中N端 16个氨基酸残基推定为信号肽序列 .将Cu ,Zn SOD编码区插入载体pET 2 2b(+ )构建表达载体pET 2 2b sodC ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导融合蛋白表达 .SDS PAGE显示 ,融合蛋白表观分子质量约 2 4kD ,占菌体裂解液中总蛋白的 2 1 3% .将此表达载体转入SOD缺陷型大肠杆菌PN132 ,赋予了该菌株对paraquat的抗性 .NBT光抑制法测定SOD活性显示 ,与PN132无SOD活性相比 ,重组子在IPTG诱导前SOD活性极低 (1 79U/mg) ,诱导后活性高达 6 9 76U/mg .非变性电泳结果显示 ,该酶活性不同程度地受到 5mmol LH2 O2 和 5mmol

褐藻胶裂解酶在枯草芽胞杆菌中的重组表达及催化特性研究

为拓展褐藻胶裂解酶在高效、安全的枯草芽胞杆菌体系中的表达,成功构建一株海洋来源的贝特氏菌(Cobetia sp.)WG-007褐藻胶裂解酶枯草芽胞杆菌工程菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-aly-cob,对主要发酵条件进行优化,并对重组酶Aly-Cob的酶学性质进行表征。结果表明,优化后的工程菌培养温度和初始pH分别为30℃和7.0,发酵培养基为添加15 g/L甘油和30 g/L酵母浸膏的TB培养基。在此条件下,摇瓶发酵48 h褐藻胶裂解酶Aly-Cob酶活为58.62 U/mL,是优化前的2.7倍。重组酶Aly-Cob最适反应温度和pH分别为40℃和7.0,Mg^(2+)、Ca^(2+)、Na^(+)和K^(+)对酶活有促进作用,该酶可特异性地降解褐藻胶及其片段。研究拓展了褐藻胶裂解酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达,为褐藻胶裂解酶的应用提供补充和参考。

蜡样芽孢杆菌溶血素BL的表达及多克隆抗体的制备

为了获得蜡样芽孢杆菌溶血素BL的三个亚基HblA、HblC和HblD的蛋白质和多克隆抗体,试验采用PCR方法分别扩增得到HblA、HblC和HblD基因片段,基于原核表达载体pET-28a构建重组表达质粒,利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞分别表达重组蛋白HblA、HblC和HblD,通过Ni2+亲和层析柱对其进行纯化,用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠制备相应的多克隆抗体,通过Western-blot检测蜡样芽孢杆菌BC12培养上清液中的溶血素BL。结果表明:试验成功构建出HblA、HblC和HblD基因的重组表达质粒;获得与预期大小相符的重组蛋白HblA、HblC和HblD,蛋白质条带大小分别为44.7,52.1,46.8 ku;制备出HblC和HblD的多克隆抗体,该抗体均能特异性识别蜡样芽孢杆菌培养上清液中的溶血素BL亚基。说明试验制备的多克隆抗体可用于蜡样芽孢杆菌溶血素BL的检测。

牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL亚基的原核表达及其生物学活性分析

蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,分布广泛,具有一定的致病性。不同的蜡样芽孢杆菌携带有不同的毒力因子,这直接决定了蜡样芽孢杆菌株致病性的差异。研究和探讨毒力因子分布以及具体毒素的生物活性有助于对蜡样芽孢杆菌病采取更科学的防控。本研究通过原核表达系统将溶血素BL三亚基重组表达,并对表达蛋白进行了纯化和部分生物学活性的检测。研究结果表明,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL可以在原核表达系统中成功表达和纯化,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL拥有溶血性、细胞毒性、很好的免疫原性以及对小鼠具有一定的免疫保护性。本研究表达了溶血素BL三亚基,并探究了牛源致病性蜡样芽孢杆溶血素BL的生物学活性。本研究为进一步揭示蜡样芽孢杆菌溶血素BL的致病作用机制和建立针对牛源致病性蜡样芽孢杆菌病的检测方法奠定了理论基础。

蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的分别对非溶血性肠毒素基因(Nhe)的3个亚基进行原核表达,并对蜡样芽孢杆菌分泌的非溶血性肠毒素蛋白进行免疫学鉴定。方法根据NCBI数据库非溶血性肠毒素NheA、NheB、NheC基因序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌的基因组为模板,PCR扩增NheA、NheB、NheC基因。分别将3个基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化到大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析以及Western blot分析,并免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组表达载体分别转化至BL21(DE3),经IPTG诱导表达相应的目的蛋白,分子质量单位分别为NheA 40ku,NheB 44ku,NheC 40ku。经电离飞行时间质谱鉴定,重组蛋白NheA、NheB和NheC表达正确。3种目的蛋白经SDS-PAGE电泳后分别割胶回收,免疫新西兰大白兔,获得重组多克隆抗体。结论成功构建了NheA、NheB、NheC基因重组表达载体,表达的重组蛋白免疫新西兰兔获得相应的克隆抗体,为进一步研究非溶血型肠毒素的结构和功能奠定了基础。