体外培养bFGF,PDGF,TGF-β对兔MSC的ALP活性和增殖的影响

目的 在正常生理与病理状态下成纤维细胞生长因子 (FGF)、血小板源性生长因子 (PDGF) ,转化生长因子 β (TGF - β)三种生长因子调节骨的生长发育 ,影响骨折的愈合过程 ,本研究探索在体外培养条件下该三种因子对新西兰白兔骨髓基质细胞增殖与分化的影响 ,为下一步观察这些因子与其它因子联合应用提供基础研究资料。方法 抽取新西兰白兔股骨上穿刺点骨髓进行体外原代培养 ,分离骨髓基质细胞 (Marrowstromalcells,MSC) ,于第 12d行传代培养 ,以 2× 10 3 个细胞 /孔 ,定量接种于 96孔板中 ,同时按照不同剂量加入上述三种因子 ,分别在培养第 10d时用酶动力法检测碱性磷酸酶活性 ,在培养第 5d细胞近于汇合时用MTT法检测细胞的增殖情况。结果 ①随着bFGF剂量增加 ,MSCALP活性呈下降趋势 ,当bFGF浓度超过 10 0ng/ml后OD值波动在 0 0 2 0～ 0 0 0 5之间 ,仅是对照组的 1/ 3弱 (P <0 0 1) ,表明MSCALP活性受到了明显的抑制。MTT结果显示 ,OD值随着bFGF的剂量增加而明显上升 ,最高值 (浓度为 6 0 0ng/ml时 )比对照组高出近一倍 ,表明bFGF明显促进MSC增殖 ,有剂量依赖性 (dose -dependent)但当浓度高于 80 0ng/ml时 ,OD值不高于对照组 ,甚至低于对照组 ,表明较高浓度的bFGF抑制MSC增殖 ;

重组人成骨蛋白-1的纯化及其生物学活性研究

目的 获得高纯度的重组人成骨蛋白-1（rhOP-1），探讨大肠杆菌表达rhOP-1的生物学活性。方法 表达rhOP-1工程菌经发酵后，裂菌、提取包涵体，层析法纯化蛋白并逐步降低尿素浓度透析复性。采用改良MTT法检测rhOP-1对NIH3T3细胞增殖和对硝基苯酚法（PNPP）检测rhOP-1对细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的影响，同时在体内通过小鼠肌袋埋植实验测定rhOP-1活性。结果 经纯化的rhOP-1纯度可达98％。体外rhOP-1浓度在0．06～6μg／ml可明显促进细胞生长和ALP活性；体内rhOP-1埋植剂植入小鼠肌间隙2周后，可明显提高体内钙含量，且成骨趋势明显。结论 原核表达的rhOP-1具有良好的生物学活性。

重组人骨形态发生蛋白-7体内外生物学活性研究

采用体外、体内两种方法同时测定原核表达重组人BMP 7(rhBMP 7)的生物学活性 ,建立rhBMP 7活性测定的标准并为推广其临床应用提供依据。在体外 ,PNPP底物比色法和MTT比色法结果表明 ,10倍、10 0倍稀释上清组与细胞共同培养 72h后碱性磷酸酶 (ALP)水平和活细胞增殖数明显高于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,而与标准品无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在体内 ,将rhBMP 7植入小鼠肌间隙后 3周 ,见软骨岛和编织骨生成 ;而将rhBMP 7与胶原载体复合后植入 ,可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨 ,血管和骨髓丰富 ;成骨率均为8/ 8。ALP水平和钙含量 ,rhBMP 7组与标准品组相比 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;复合组则明显高于单独植入rhBMP 7和胶原两组 (P <0 .0 5 )。