IDENTIFICATION OF ALTERNARIOL, ALTERNARIOL MONOMETHYL ETHER AND ZEARALENONE BY PARTICLE BEAM LC/MS

A method for simultaneously analyzing altemariol(AOH), altemariol monomethyl ether (AME) and zearalenone(ZEA) by particle beam LC/MS was established, LC separation was accompiished with a solvent system of methanol and water (80:20 v/v). The followed particle beam LC/MS analysis gave searchable spectra of AOH. AME and ZEA. Application of this technique to analysis of an alternaria culture confirmed the presence of AOH and AME.

交链孢酚单甲醚(AME)特异性抗体研制(Ⅰ)

交链孢霉是污染粮食、蔬菜、烟草等植物的常见霉菌,该霉菌能产生多种毒性代谢物,交链孢酚单甲醚(Alternariol Monomethyl Ether简称AME)是其中主要毒素之一,本文介绍了将AME重氮化,然后将AME偶氮化合物与牛血清白蛋白(BSA)进行交联制成完全抗原,用AME-BSA完全抗原免疫家兔制备抗AME抗体。并将AME标记上半乳糖苷酶,用标准AME与之竞争,通过ELISA竞争试验,绘出标准曲线图,证明所制备的抗AME抗体能与标准AME进行特异性结合,可用于粮食中AME含量的检测。

互隔交链孢霉毒素AME和AOH合成物的诱变性

对互隔交链孢霉毒素——交链孢酚单甲醚(Alternariol monomethyl ether,AME)和交链孢酚(Alternariol.AOH)的合成物进行了细菌回复突变试验.检测其诱变性。结果表明:AME和AOH提取物和合成物(不加S_9)对鼠伤寒沙门氏菌TA102菌株和大肠菌ND-160菌株.均显示致突变效应.而后者对AME和AOH更为敏感。用相同剂量.AOH对大肠杆菌ND—160菌株诱变比值(MR)比AME高2～7倍,表明AOH的诱变性更强。合成物与提取物相比,合成物的诱变作用较强。

失活乳酸菌去除链格孢酚单甲醚的工艺优化

目的筛选高效吸附链格孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)的灭活菌种,对菌粉去除AME的工艺进行优化。方法首先,通过高效液相色谱法鉴定灭活菌粉对AME的吸附能力,筛选出AME的吸附能力最强的A1-11菌株。然后,单因素试验分析灭活乳酸菌菌粉添加量、AME质量浓度、吸附时间、pH对AME去除率的影响。最后,采用响应面法Box-Behnken设计对吸附AME的工艺条件进行优化。结果得出最适吸附条件为灭活乳酸菌菌粉添加量1.2 g、AME质量浓度0.30μg/mL、吸附时间27 h、溶液pH 4.5,预测AME去除率为51.05%,实际试验的AME去除率为50.98%。同时建立了AME去除率与各因素间的二次多元回归方程。并对该模型进行了验证,结果表明模型拟合程度高,与模型预测结果相近。结论筛选出A1-11菌株吸附AME的能力最强的,研究结果可对林果中AME的脱除提供实际应用价值。

高效液相色谱和高效液相色谱－质谱法测定粮食中互隔交链孢霉醇、互隔交链孢霉醇单甲醚及玉米赤霉烯酮

建立了粮食中互隔交链孢霉醇（ＡＯＨ）、互隔交链孢霉醇单甲醚（ＡＭＥ）和玉米赤霉烯酮（ＺＥＡ）三个毒素的ＨＰＬＣ定性定量分析法和粒子束ＬＣ－ＭＳ／ＥＩ￣＋鉴定方法。采用反相色谱，以８０％的甲醇水溶液作流动相，这三个毒素在Ｃ＿（１８）色谱柱上彼此间均获得较好的分离。方法对粮食中ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素的回收率均在７９％以上。ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素的最低检出限为１×１０￣（－９）ｇ。用所建方法对１００多个大骨节病病区、非病区的粮食样品进行了检测，结果为阴性。对７个互隔交链孢霉菌培养物检测的结果表明这些培养物中不同程度地产生了ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素，含量为１３．０～９５．９ｍｇ／ｋｇ。并用粒子束ＬＣ－ＭＳ技术成功地对这两个毒素进行了鉴定。

链格孢霉培养粮拟致雏鸡克山病、大骨节病模型的实验报告

目的:克山病和大骨节病的病因至今都不明了。本文将病区小麦中检出的优势菌链格孢霉产毒株扩增培养,以此培养粮47％的饲料(内含AOH65.19μg/g)致雏鸡模型实验,为该真菌毒素中毒说的评估提供依据。结果:①实验组除体重增长慢、羽毛光泽度差外,它如软骨生化3组分,胫骨上骺软骨增殖层上界至干骺端顶部厚度,股骨重量、长度和横径乃至胫骨上部组织学所见皆与对照组的无明显差异;②实验组肝、心、肾未见浊肿、脂变及坏死等;③实验组肝GSH—Px活性和Cytp-450量未降低、MDA量不增加。结论:以11.6mg.AOH/kg.BW.d染毒剂量实验28天,未能引发出雏鸡任何类似克山病或大骨节病的病变,也未见重要器官明显病变或中毒迹象。链格孢霉素与克、大两病发病是否相关需另做进一步的探讨。

交链孢酚单甲醚对人胚食管DNA结合作用的研究及其结合键型的鉴别

应用吸收光谱分析法研究了交链孢酚单甲醚(Alterariol Monomethyl Ether,AME)对人胚食管DNA之间的结合作用并对结合的键型作了鉴别。研究表明,AME和DNA在37℃条件下,二者的最大吸收峰向长波方向明显位移。而且在AME和DNA结合之间存在剂量效应关系。AME和人胚食管DNA结合的最大分子比例(以AME:脱氧—磷酸核苷计)为5:1000,结合反应的平衡常数K=2.8×10~6,结合作用发生迅速而稳定。结合部位可能在碱基,无明显的碱基特异性。热变性DNA能结合更多的AME分子,说明二者的结合不需要DNA具有完整的二级结构。盐离子可严重干扰二者的结合,而脲对此则不产生明显影响,提示AME与DNA结合的主要键型为离子键而不是氢键型。AME与人胚食管DNA这种以离子键结合的方式可能在AME的诱变性/致癌性中起重要作用。

互隔交链孢酚单甲醚对线粒体超氧化物歧化酶的影响

本文观察了互隔交链孢霉的产物之一——交链孢酚单甲醚(AME)对小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)的影响:①给小鼠腹腔内注射不同浓度的AME,发现AME使肝匀浆CuZnSOD活性显著降低,MnSOD活性全部丧失。线粒体内的MnSOD及CuZnSOD活性伴随着AME浓度的提高,活性逐渐下降,与对照组相比,差异有显著性。②给小鼠腹腔内注射同一浓度的AME(90.9mg/kg),给药10天后CuZnSOD、MnSOD活性降低。提示:AME有降低超氧化物歧化酶活性的作用。

互隔交链孢酚单甲醚对脂质过氧化的影响

本文观察了互隔交链孢霉的产物之一──交链孢酚单甲醚（ＡＭＥ）对小鼠体内脂质过氧化的影响。给小鼠腹腔内注射不同浓度的ＡＭＥ，结果表明；低浓度的ＡＭＥ（５４．５ｍｇ／ｋｇ体重）降低了脂质过氧化物的生成，随着ＡＭＥ浓度的增加，脂质过氧化物的含量显著增加。

小鼠灌服^3H交链孢酚单甲醚的体内蓄积作用

与单次灌胃相比,小鼠连续三次灌服~3H-AME后24 h,其血、胃肠道及内容物中有明显的放射性升高,各组织则未见升高;灌服后第4d测定,在胸腺、直肠、脑和皮肤等组织有明显的放射性升高,而食管、前胃、睾丸、小肠等组织则无明显升高。说明多次摄入AME后,先在血中累积,而组织中累积较晚,在所有组织中食管累积最不明显,可能与AME和食管上皮细胞的结合具有特异性强、亲和力高有关。

二苯-α-吡喃酮类链格孢霉毒素和人血清白蛋白的相互作用及机理探究

为探究链格孢酚单甲醚(AME)和链格孢酚(AOH)这两种二苯-α-吡喃酮类链格孢霉毒素与人血清白蛋白(HSA)之间的分子相互作用及机理,本研究模拟血液生理pH值,采用稳态荧光光谱、同步荧光光谱、3D荧光光谱以及圆二色光谱等方法研究两者之间的相互作用。结果表明,AME和AOH与HSA相互作用均发生了静态猝灭,具有较高亲和力,以氢键和范德华力(ΔH<0,ΔS<0)结合形成1:1复合物,互作过程中这两种类毒素破坏了人血清白蛋白中稳定二级结构的氢键网络,使蛋白二级结构展开,且AME和AOH使人血清白蛋白中的α-螺旋结构含量从48.93%分别减少至39.41%和44.01%,并使色氨酸残基极性降低、疏水性增加,但酪氨酸残基极性变化不大,即结合位点可能位于色氨酸残基所在的空腔(即结合位点I);AME对HSA的猝灭程度、猝灭常数(K_(sv))及结合常数(K_(a))均大于AOH,结合距离也更小(r_(AME)=2.56 nm<r_(AOH)=2.60 nm)。本研究结果为进一步探究二苯-α-吡喃酮类链格孢霉毒素的毒代动力学和药代动力学,完善丰富其毒理学相关资料,以及进行风险评估和在食品中限量标准的制定提供了参考依据。

胶束电动毛细管色谱法分析3种交链孢毒素主成分含量

目的 建立胶束电动毛细管色谱法(micellar electrokinetic chromatographic, MEKC)测定3种交链孢毒素[交链孢酚(alternariol, AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)和交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)]主成分含量的新分析方法。方法 以未涂层熔融石英毛细管柱(50μm×30 cm, 20 cm, i.d.)为分离柱,分别以3种分离缓冲溶液[40 mmol/L Na_2B_4O_7-120 mmol/L十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)(含体积分数为5%的乙腈)、30mmol/LNa_2B_4O_7-40mmol/LSDS(含体积分数为30%的异丙醇)和60mmol/L Na_2B_4O_7-180 mmol/L脱氧胆酸钠]及2种样品缓冲溶液[8 mmol/L硼砂(含体积分数为57%的甲醇用于AOH和TeA)、8mmol/L硼砂(含体积分数为57%的异丙醇用于AME)]分析AOH、AME和TeA的主成分含量。结果 AOH、AME、TeA的方法精密度分别为0.05%、0.01%和0.21%(n=5),检出限分别为5、15和0.5 mg/L。主成分含量分别为99.94%、99.78%和97.28%,且与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)的结果无显著差异(α=0.05)。结论 MEKC法可作为HPLC法测定3种交链孢毒素主成分含量方法的互补方法 ,能够满足3种交链孢菌毒素主成分含量分析的要求。

农产品及其制品中交链孢酚和交链孢酚单甲醚研究进展

交链孢菌(Alternaria spp.)是一类重要的植物病原体,能产生多种毒素,其中交链孢酚(alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)是目前从食物中检出的比较普遍和主要的2种交链孢毒素,可广泛污染蔬菜、水果及谷物等农产品及其制品。本文对AOH和AME的结构及理化性质、毒性、产生影响因素、生物及化学合成和污染现状等进行了综述,并对交链孢毒素限量标准的制定、快速检测方法等进行了展望。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定浓缩苹果汁中的4种链格孢霉毒素

建立了浓缩苹果汁中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚4种毒素残留量的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品用水稀释后,用PS DVB固相萃取柱净化,外标法定量。测定时用BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm)分离,乙腈和水梯度洗脱,质谱测定采用多反应监测(MRM)模式。4种链格孢霉毒素的测定低限在1.0～5.0μg/L范围内,加标回收率为77.8%～117.2%,相对标准偏差均低于9.7%。该方法灵敏、稳定、可靠,可用于浓缩苹果汁样品中4种链格孢霉毒素的检测和确证。

白光光照对交链孢毒素合成的调控研究

目的研究白光光照对交链孢(Alternaria)毒素合成的影响。方法在光/暗培养条件下,比较分析白光光照对2种交链孢菌株(ATCC 66981和Pear-3)的菌丝生长、孢子形成以及毒素合成的影响。结果持续白光照射对交链孢菌丝生长影响不显著,而显著抑制其孢子形成。光照刺激交链孢菌ATCC66981中交链孢酚(alternariol, AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)和腾毒素(tentoxin, TEN)3种毒素的产生。菌株持续光照培养30d,AOH、AME和TEN毒素浓度分别为120、182和173?g/L;较之黑暗培养,分别增加了1.1、5.9和9.6倍。光照抑制交链孢菌Pear-3中细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)毒素的合成。菌株光照培养6 d, TeA毒素浓度达到142?g/L;而黑暗培养后其浓度高达325?g/L,毒素产率增加了1.3倍。结论光照不影响交链孢菌丝生长,而对孢子形成影响显著;持续白光照射能够促进交链孢中AOH、AME和TEN毒素的产生,而抑制TeA毒素的产生。

交链孢酚和交链孢酚单甲醚生物合成调控研究进展

交链孢酚和交链孢酚单甲醚是由丝状真菌链格孢属产生的次级代谢产物,广泛存在于谷物、水果和蔬菜中,是食品和饲料生产、加工、运输及储存过程中最普遍和不可避免的污染物。不仅会造成巨大的经济损失,而且威胁人类健康。测定交链孢酚和交链孢酚单甲醚的含量,对保障食品质量安全极其重要。标准物质是保证食品中毒素分析检测数据准确、可靠的基础,对毒素的监测具有重要意义。目前,交链孢酚和交链孢酚单甲醚产量低,国内外均无大量制备,进而导致标准物质缺乏,难以满足应用需求。针对这一现状,提高菌株中毒素的产量成为亟待解决的问题。随着分子生物学的发展,这2种毒素的生物合成途径虽已鉴定,但对毒素生物合成过程的调控机制知之甚少。本文概述了交链孢酚和交链孢酚单甲醚生物合成及其调控机制的研究进展,以期为交链孢霉菌株的改造提供借鉴,进而降低生产成本,储备交链孢毒素,为食品安全及质量控制提供物质基础。

食品中交链孢酚和交链孢酚单甲醚的危害评估

目的对交链孢酚(alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)可能对人体健康产生的有害影响进行危害评估。方法本研究采用系统文献检索方法,确定研究对象和研究内容,制定检索策略进行系统文献检索。通过NoteExpress软件进行文献查重,并通过人工筛选获得文献,纳入危害评估报告。结果AOH和AME是食品污染中常见2种链格孢毒素。其污染食品以植物性膳食为主,其中谷物的污染占主要地位。体内毒代动力学研究显示,AME大部分不被吸收,经粪便排出。胃肠道对AOH的吸收性研究结果存在差异。体外代谢研究显示,AOH和AME的I期生物转化为2-、4-、8-和10-羟基衍生物。II期生物转化为硫酸盐缀合物,其代谢产物可能具有毒理学相关性。AOH和AME动物毒性资料不充足,现有研究显示,AOH和AME具有急性毒性:AOH和AME腹腔注射DBA/2小鼠LD50值大于400 mg/kg·bw。AOH和AME已有较为明确的体外遗传毒性数据,且体内毒性研究显示AME对SD大鼠具有遗传毒性,可诱导基因突变、染色体断裂和DNA损伤。但AOH对雄性SD大鼠的体内遗传毒性不明确,可能会累积诱导遗传突变。亚急性毒性研究显示,AOH和AME可致动物肝、肾和脾受损。经口途径或经皮下注射给予小鼠AME均未显示胚胎毒性效应。但一定剂量下经皮下注射AOH或者AOH+AME(1∶1)混合物显示出胚胎毒性。AOH和AME尤其是AOH可能有类雌激素效应,通过影响黄体酮和类固醇等合成而影响哺乳动物生殖发育。体内外研究表明,长期暴露于链格孢毒素可能是诱发食管癌的危险因素。体外研究显示,AOH和AME可影响细胞活性、抑制细胞生长、抑制蛋白质合成,并诱导细胞凋亡,且两者可能具有协同毒性作用。结论EFSA专家组设定AOH和AME的毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern,TTC)分别为2.5 ng/kg·bw/d。根据AME多终点28 d毒性试验研究结果,推导出人类AME遗传毒性BMDL10对应的关键评估终点值(point of departure,PoD)PoD为5.33ng/kg·bw/d。鉴于上述AOH和AME的毒性效应,且AME+AOH可能具有联合毒性,需关注AOH和AME及其联合暴露可能引发的人类健康风险。

链格孢霉醇和链格孢霉醇单甲醚产生菌株的筛选

本文对分离自小麦、马铃薯、番茄和茄子上链格孢霉属(Alternaria)2个种(链格孢和茄链格孢)的96个菌株,用枯草杆菌生长抑制试验筛选链格孢霉醇(AOH)和链格孢霉醇单甲醚(AME)的产生菌株,有48株产生毒性作用(占所测菌株的50％)。18株产强、中毒性菌用高效液相色谱分析,有13株产AOH和AME(占所测菌株的72.2％)。链格孢的产毒素菌株率比茄链格孢低。但产毒素含量却是前者明显高于后者。其中产AOH和AME的最高含量,链格孢菌株XA-8分别为280和5140mg/kg,而茄链格孢菌株SA-10分别为95.9和94.3mg/kg。