扩增X-Y同源Amelogenin基因内含子在性别鉴定中的应用研究

本文用一对针对X－Y同源的Amelogenin基因第一内含子的引物，于同一试管中分别扩增出针对于x和Y染色体的特异性DNA片段：106bp及112bp的PCR产物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染法观察扩增结果，取得了满意的效果．对50pgDNA模板室温放置16年的血痕及单根毛发、烟头等检材均可得到明确的性别鉴定结果．本实验证明该方法简便、灵敏、可靠、特别适用于腐败降解检材的法医学性别鉴定．

考古样品中Amelogenin同源基因的提取和检测

目的利用人类性染色体Amelogenin同源基因在X、Y染色体上序列长度的差异,选择设计引物,对考古样本进行古DNA性别信息研究。方法采用苯酚/氯仿-二氧化硅-超滤离心方法提取东岭墓葬群殉人骨骼、牙齿古DNA,PCR扩增,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离和检测古DNA扩增片段。结果8个墓葬16个样品中有7个样品出现阳性扩增检测,目标基因片段清楚,男性为二条带(X、Y),女性为一条带(X),牙齿样品检测成功率优于骨骼样品。结论改进的苯酚/氯仿—二氧化硅—超滤分离法是较好的古DNA提取方法,具有降低PCR抑制剂、消耗成本低和提取成功率高等特点。基于人类X、Y染色体Amelogenin同源基因的古DNA性别分析方法可成为分子考古重要的技术方法。

孕妇血浆Amelogenin基因6bp差异检测对产前胎儿性别的鉴定价值

目的建立一种可靠性强的非创伤性鉴别胎儿性别的方法。方法根据Amelogenin基因第3内含子在XY染色体上6bp的差异,采用PCR技术扩增孕妇血浆游离DNA,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色鉴定其基因型,从而判断胎儿性别。结果32例孕妇血浆DNA标本中,19例被诊断为男性,13例被诊断为女性,所得结果与产后胎儿实际性别相比较,符合率为96.88%。结论通过检测孕妇血浆DNAAmelogenin基因6bp差异产前诊断胎儿性别方法可行,结果可靠。

扩增Amelogenin基因用于生物检材种属鉴定

目的扩增Amelogenin基因测定血痕或组织的种属,以确定在法医学检验中的应用价值。方法收集猪、羊、马等10几种常见动物的血痕或肌肉组织,应用PCR扩增Amelogenin基因,PAGE电泳,银染后观察结果。结果哺乳动物猪、牛、狗、羊、马、驴动物血痕扩增产物为1条带,片段长度102bp。猕猴检见106bp和112bp两条带,与人血痕没有区别。兔、猫、鼠血痕未检出特异性片段。其它常见物种鳝鱼、青蛙、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、麻雀等均未见扩增产物。结论扩增Amelogenin基因进行种属鉴定,方法简单,灵敏度高,可应用于法医检案。

亲子鉴定中男性个体Amelogenin基因座异常1例

本文报道1例亲子鉴定中男性个体Amelogenin基因座仅检出Amel-Y等位基因,未检出Amel-X等位基因的案例,并就其发生的原因以及对法医物证鉴定工作的影响进行探讨。

基于AMEL基因的绵羊性别鉴定技术

[目的]探讨将牙釉蛋白(AMEL)基因用于绵羊性别鉴定的可行性。[方法]采用酚-氯仿法从湖羊的耳皮肤组织中提取基因组DNA。分别以公羊和母羊的DNA为模板,以AMEL引物和SRY引物进行PCR扩增。[结果]经扩增后母羊得到一条来自X染色体的270bp条带,而公羊则得到270和210 bp的两条带。两种方法对10份已知DNA样品检测结果与实际性别完全一致。PCR产物的电泳条带较为清晰,相同性别电泳条带数完全一致,而不同性别间电泳条带数和片段大小差异显著。AMEL引物扩增雌性个体DNA实际电泳条带数和理论条带数一致,而来自雄性结果却不一致,这可能与非特异性扩增有关。[结论]AMEL基因比SRY基因具有更高的灵敏性,可用于判定XY染色体动物的性别。

基于AMEL基因位点差异的水牛性别PCR鉴别方法

【目的】建立检测不同性别水牛染色体AMEL基因位点差异的PCR鉴别方法,为水牛早期胚胎性别鉴定及水牛分离精子重分析提供简便可靠的检验手段。【方法】采用PCR扩增不同性别水牛染色体中的AMEL基因,Clone Manager 9.0软件分析序列差异,BLASTn程序分析基因同源性,MEGA 6.06软件构建系统发育进化树。【结果】以水牛血液基因组DNA为模板、amel B1为引物,引物退火温度60℃,公水牛可扩增出两条清晰条带,长度分别为376（AMEL-X基因）和304 bp（AMEL-Y基因）;母水牛仅扩增出1条清晰条带,长度为376 bp（AMEL-X基因）。与AMEL-X基因相比,水牛AMEL-Y基因缺失155-226区域的72 bp,同时存在20个基因型多态位点。临床检测结果证实,基于AMEL基因的PCR鉴别结果与实际性别的吻合率达100%,amel B1引物的灵敏度为0.5 ng模板量。BLASTn比对分析结果显示,水牛AMEL-X和AMEL-Y基因与不同哺乳动物的对应序列存在高度保守性,其相似性均接近或高于90%,与牛存在最近的亲缘关系。【结论】AMEL基因在哺乳动物中高度保守,且在不同性别水牛中呈多态性特征,以其作为分子靶标建立的水牛性别PCR鉴定方法切实可行,为水牛早期胚胎性别鉴定及水牛分离精子重分析提供了一个更便捷、高效的检验手段。

中国人群Amelogenin基因的突变频率和突变类型

目的调查Amelogenin基因在中国人群的突变频率和突变类型,评估其对性别鉴定的影响。方法采用PowerPlexR16系统对8850名已知性别的中国无关个体进行Amelogenin基因内含子1区6bp缺失的检测,统计分型异常的个体,采用Amelogenin基因其它引物体系和Y染色体短串联重复序列（Yshort tandem repeats,Y-STR）基因座对突变样本进行验证并测序。结果在男性群体中检出2例X染色体Amelo-genin（AMELX）等位基因丢失的样本和2例Y染色体Amelogenin（AMELY）等位基因丢失的样本,总突变率为0.045%,男性群体中的突变率为0.085%。对丢失的AMELX等位基因测序,在其正向引物结合区检出2种点突变,推测因此产生无效等位基因,该类突变在男性群体中约为0.042%;AMELY等位基因丢失在男性群体中的突变率也为0.042%,其中1个样本在12个Y-STR基因座中有10个基因座扩增失败,推测在Y染色体上包括AMELY和Y-STR基因座在内的较大片段缺失。结论Amelogenin基因突变会造成AMELX等位基因或AMELY等位基因丢失,将干扰性别鉴定,导致性别错判,在检验时值得注意。

荧光引物扩增AMG基因鉴定古代人骨遗骸的性别

建立一种用荧光标记引物扩增AMG基因的性染色体同源片段方法,对古代人骨遗骸进行性别鉴定.用其测定5个古代遗骸的性别,其结果与形态学结果一致.

Cbfαl对釉原蛋白转录调控作用的初步分析

目的:研究Cbfαl对釉原蛋白启动子转录活性的影响。方法:利用生物信息学的方法分析釉原蛋白启动子区域的序列,确定可能存在的结合位点,将利用PCR及酶切的方法从小鼠C57BL/6J基因组上扩增的、不同长度的釉原蛋白启动子构建的虫荧光素酶报告载体与Cbfαl共转Hela细胞,分析Cbfαl对不同长度的启动子转录活性的影响,将包含整个启动子区域的报告载体与Cbfαl共转Hela、CHO、UMR-106细胞,分析在不同细胞中Cbfαl对全长启动子转录活性的影响。结果:在Hela细胞中,Cbfαl对各段启动子都有激活作用,且该作用不随着启动子长度的变化而变化,在CHO、UMR-106细胞中,Cbfαl对启动子转录活性的影响很弱。结论:在Hela细胞中,Cbfαl对釉原蛋白启动子的转录活性有明显的增强作用,而且在对逐步缩短的启动子表现出一致的增强效能。结合生物信息学对Cbfαl结合位点的分析,可以初步判断在启动子下游,第一个内含子中存在Cbfαl的作用位点。另外,这种增强作用表现出明显的上皮细胞特异性,表明Cbfαl对釉原蛋白启动子的增强作用是有组织特异性的。

运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断

目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的可行性。方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因。结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0。结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用。

牙釉质基因巢式PCR鉴定猪ICSI胚胎性别

【目的】建立可准确鉴定猪胚胎性别、可靠的巢式PCR反应体系及研究卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)对胚胎性别的影响。【方法】根据猪X染色体和Y染色体上牙釉质基因(Amelogenin gene,AMEL)第三内含子上9～10 bp的缺失设计了巢式PCR引物,并利用10个猪耳组织基因组DNA样品优化了PCR扩增条件,巢式PCR—荧光标记的半自动基因组扫描技术鉴定205个猪ICSI早期囊胚性别。【结果】特异性扩增了199个ICSI样品,6个ICSI胚胎扩增失败。经PCR产物片段扫描,只在178～179 bp处有峰的,判定为雌性胚胎,在169～171和178～179 bp 2处有峰则判定为雄性胚胎。共确定雄性胚胎71个,雌性胚胎128个,其中公母比例1∶1.8。【结论】基于牙釉质基因的巢式PCR方法可用于猪胚胎性别鉴定。性别比例偏离在一定程度上说明在ICSI囊胚中存在部分孤雌胚胎。

荧光标记引物miniCTTA复合扩增系统的建立

目的建立扩增片段<130bp,包括CSF1PO、TH01和TPOX及性染色体amelogenin基因座的miniCTTA扩增系统。方法采用不同荧光染料标记引物,通过PCR扩增,利用ABI3100遗传分析仪进行片段长度分析,对100份无关个体血样,10个家系样本以及30份高度降解检材进行检测。结果miniCTTA系统DNA分型结果与AmpFLSTRIden-tifiler试剂盒完全一致。结论miniCTTA系统可以应用于个人识别和亲权鉴定,为降解DNA样本分型提供了新的方法。

Amelogenin基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中的价值

目的 探讨Amelogenin基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中的价值。 方法 采用Amelogenin基因的一对特异性引物 ,扩增X -Y同源基因。再采用微量薄板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,结合银染 ,检测X与Y同源基因。一次成像记录结果。结果 采用该方法 ,对 2份脐血中男性出现二条带 (X、Y) ,女性出现一条带 (X)。 2 5份绒毛样本 13份出现二条带 ,12份为一条带。 2 5份羊水样本中 10份出现二条带确定为男性胎儿 ,15份出现一条带为女性胎儿 ,与产后随访结果一致 ,符合率 10 0 %。结论 ①Amelogenin基因分析技术可用于产前诊断胎儿性别及伴性遗传病的研究 ,并具有科学和实用的优点。②该技术也可广泛用于法医学性别鉴定、运动员性别鉴定及骨髓移植植活诊断等。③同时有X产物做内对照 ,有效防止单扩增Y染色体为基础技术的假阳性和假阴性结果及等位基因丢失现象。

新石器时代人骨遗骸中古代DNA的提取及X-Y染色体同源基因片段的PCR扩增

从中国新石器时代人骨遗骸中提取出古代DNA。通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到X-Y染色体上的单拷贝同源基因片段(Amelogenin Gene)。由于扩增的基因片段长度具有性别多态性,从而为古代人骨和牙齿提供了分子生物学的性别鉴定。

应用牙釉质基因鉴定绒山羊早期胚胎的性别

采用酚-氯仿法和煮沸法从南疆绒山羊血液和早期胚胎中提取基因组DNA,分别以雄羊和雌羊的血液基因组DNA和早期胚胎基因组DNA(约20～30胚胎细胞)为模板,以AMEL引物进行PCR扩增和电泳分析.结果表明:绒山羊5ng量和10pg量血液基因组DNA经扩增后雌性只得到1条非特异性带,雄性得到1条非特异性带和1条特异性带;超微量血液基因组DNA样本(10pg)经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别;32枚绒山羊胚胎鉴定结果,雄雌性别比17/15;移植胚胎产羔雄雌比15/14.采用牙釉质基因(AMEL),经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别,并对胚胎无损伤;南疆绒山羊早期胚胎性别鉴定结果与胚胎移植后产羔性别结果对比,雌雄性别比率差异不显著(P>0.05).

单细胞单轮二重PCR诊断X-连锁鱼鳞病

X-连锁鱼鳞病(X-linked ichthyosis,XLI)是隐性遗传病,是人类最常见的先天性代谢疾病之一.从单细胞水平诊断XLI,就可为开展XLI的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)打下基础.采用单轮二重PCR扩增患者和正常女性的单淋巴细胞以及正常人单卵裂球的STS基因和amelogenin(Amel)基因,在正常人单淋巴细胞组和正常人单卵裂球组中STS基因扩增成功率分别为95.8%、90.9%,在患者单淋巴细胞组中的假阳性率为1.5%;在Amel-X和Amel-Y基因位点扩增成功率分别为91.9%、92.7%,污染率分别为1.4%、0;ADO的发生率为6.2%.结果表明单细胞单轮二重PCR诊断XLI具有较高的准确性和特异性,有助于我们进一步开展XLI的PGD.

PCR扩增牙釉基因X和Y染色体不同序列鉴定羊早期胚胎性别

利用羊牙釉基因特异性引物扩增羊血液、成纤维细胞和胚胎DNA,旨在优化羊早期胚胎性别鉴定的方法。结果表明,利用两温度PCR扩增母羊DNA样品获得1条来自X染色体289 bp产物,PCR扩增公羊DNA样品获得2条产物,其中280 bp扩增产物来自Y染色体,235 bp扩增产物来自X染色体,50头已知性别羊样品鉴定的准确率为100%。试验优化了一种两温度PCR快速鉴别羊及其早期胚胎性别的方法。

孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白基因和DYS19位点检测

目的:检测孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白(Amelogenin)基因和DYS19位点,探讨其对男性胎儿性别诊断的可能性与准确性,为伴性遗传病的产前诊断提供参考。方法:采集22例正常孕妇外周血2mL,以1例未婚无妊娠史女性为阴性对照、1例正常男性为阳性对照。提取血浆DNA作为PCR模板,以巢式PCR技术分别扩增Amelogenin基因和DYS19位点,并将实验结果与娩出后的新生儿实际性别比较。结果:孕妇外周血血浆中Amelo-genin基因检测与娩出后新生儿实际性别符合率为95.5%,DYS19位点检测符合率90.9%,2指标检测结果与胎儿实际性别符合率较高(kappa=0.909,P=0.088;kappa=0.820,P=0.120)。Amelogenin基因与DYS19位点检测的一致率为95.2%。结论:Amelogenin基因和DYS19位点预测胎儿性别符合率无差异。联合检测Amelogenin基因和DYS19位点,可以提高诊断结果的可信度。

牙釉质基因鉴定山羊性别的研究

根据牙釉质(amelogenin,AMEL)同源基因在山羊X、Y染色体上存在不同程度碱基缺失的特点,设计1对引物,对山羊血液基因组DNA混合样进行PCR扩增,将PCR产物纯化、克隆并测序;然后对46个山羊血液DNA样本(♀:22个,♂:24个)进行性别鉴定。结果显示,雌性山羊样品经扩增只产生一条非特异性条带,雄性山羊样品产生一条非特异性条带和一条特异性条带;非特异性片段长度为349 bp,特异性片段为289 bp;46个山羊血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雌性准确率为100%(22/22),雄性准确率为100%(24/24)。