甘蓝型油菜Bn19070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bn19070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR-NAi(人工微RNA干扰)技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90%以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bn19070的功能研究有借鉴作用。

棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了棉花△-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158 bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515 bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302-amiRNA-FAD2-1。

amiRNA介导的兼抗PVX、PVY、PSTVd马铃薯植株获得及抗性鉴定

为获得兼抗多种病毒(类病毒)的马铃薯植株,分别克隆了靶向PVX、PVY和PSTVd蛋白的P25、HC-Pro和Virp1基因,以拟南芥pre-miR159a为骨架设计了针对P25、HC-Pro和Virp1基因的amiRNA序列,通过Overlapping PCR将3个amiRNA片段连接,并导入植物双元表达载体pCAMBIA1300-221,构建植物表达载体p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1,经PCR及酶切验证,表达载体构建正确。农杆菌介导法将含目的基因质粒菌液侵染马铃薯品种费乌瑞它脱毒微型薯片,经再生、压力筛选,抗性植株分化及植株壮苗共获得转化株系15株,PCR检测结果表明,其中10株检测到与目的基因大小一致的片段(729 bp)。qRT-PCR结果显示,外源amiR-P25-HCPro-Virp1基因在10个转化植株中均有表达,相对表达量在7.68~21.37。对T0阳性转化植株的攻毒试验,将PVX、PVY和PSTVd病毒等量混合液摩擦接种至6~8叶期的植株叶片,20 d后观察发现,对照植株感病严重,出现植株矮小、叶片斑驳等症状,而转化植株未表现出感病症状,生长正常。RT-PCR进行病毒特异性检测,结果显示,转化植株中也未检测到病毒序列,这表明转amiR-P25-HCPro-Virp在转化植株中能稳定表达,转化植株能够兼抗PVX、PVY和PVSTd 3种病毒(类病毒)。得到了同时兼抗PVX、PVY和PVSTd转化植株,且抗性显著,为马铃薯抗病毒育种提供了新的遗传资源。

P119驱动amiRNA介导的PL基因沉默对草莓果实硬度的影响

果胶裂解酶基因(Pectate lyase,PL)是调控果实软化的重要靶点。本研究测定了红颜草莓果实在发育过程中果胶裂解酶活性变化和硬度变化规律,并通过人工小干扰RNA(artificial micro-interfering RNA interference,amiRNA)技术,以拟南芥miR390a前体序列作为沉默PL基因的骨架,在番茄果实特异性启动子P119的驱动下,通过农杆菌介导转入草莓果实中瞬时表达,通过RT-PCR分析草莓瞬时转染后PL基因的表达量,并检测了PL沉默对果实硬度的影响。结果表明,随着草莓果实发育的推进,果胶裂解酶活性呈逐渐上升趋势,与果实硬度呈负相关;构建了基于拟南芥miR390a为骨架的amiRNA靶向栽培草莓中的PL基因;在番茄果实特异性启动子P119驱动下,miRNA前体可以在草莓果实中瞬时表达;草莓果实中总PL基因表达量下降达34. 5%;基因沉默组果实硬度比对照组更高,且沉默对果实颜色发育进程无明显影响。该结果表明:果胶裂解酶主要在果实发育后期调节细胞壁的解离,采用amiRNA沉默PL基因可以延缓草莓果实软化进程。

amiRNA技术及其在食用作物遗传改良中的应用

内源miRNAs(microRNAs)是负调控真核生物基因表达的关键因子。amiRNAs(artificial microRNAs)是模拟内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,它能高效抑制靶基因的表达。运用amiRNA技术调控基因表达在调控精确性、效率、遗传稳定性及生物安全性等多方面具有显著优势。本文就amiRNA技术的原理、优势以及该技术在食用作物品质改良及营养改善、雄性不育系培育、抗病毒和抗逆作物培育中的应用进行了综述。

甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建

根据拟南芥MS1基因已知保守序列设计特异性引物,分离克隆甘蓝型油菜中与拟南芥MS1基因同源的基因片段。应用PCR-Walking技术获得甘蓝型油菜核雄性不育基因BnaX.MS1.a,其全长3 424 bp。BnaX.MS1.a基因与拟南芥MS1基因全长序列同源性为60.3%,编码序列同源性为89.5%。根据基因序列比对结果推测开放阅读框长2 004 bp,编码667个氨基酸,分子量为76.5 kD,等电点为8.01。BnaX.MS1.a基因编码的氨基酸序列与已知拟南芥MS1基因编码的氨基酸序列同源性达93%。构建BnaX.MS1.a基因的amiRNA载体转化甘蓝型油菜,旨在研发核不育基因工程油菜。

amiRNA抗病毒策略及其在植物抗病毒研究中的应用

人工小RNA(artificial microRNA,amiRNA)抗病毒策略是通过内源miRNA(microRNA)的作用机制人为沉默病毒靶基因,该策略稳定有效且能对多种病毒产生抗性。利用该策略,已经获得了多种抗病毒转基因植物。介绍了amiRNA抗病毒策略的机制、特点及利用该策略防治植物病毒病害的研究进展。

棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建(英文)

采用RT-PCR方法克隆了棉花-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体,pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302-amiRNA-FAD2-1。

串联序列amiRNA稳定转染后对cccDNA的影响

目的:观察优化设计的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体长期干扰乙型肝炎病毒(HBV)后,对HBV复制源泉cccDNA的影响。方法:将前期构建的针对HBV RNA干扰效率高的单一序列及串联序列amiRNA质粒表达载体,瞬时转染入HepG2.2.15细胞,筛选出稳定转染细胞株,观察其对cccDNA的影响。结果:稳定转染单一序列amiRNA-HBV-4组相对于阴性对照质粒,对HBV cccDNA的抑制率为93.78%;串联序列amiRNA-HBV3-4组为99.65%,二者比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论:构建的针对HBV的新型amiRNA质粒表达载体可较明显地抑制HBV复制的根源cccDNA,串联序列组效果更佳,为进一步进行体内实验奠定了基础。

麻竹DlSCL6基因amiRNA前体合成及表达载体构建

Web MicroRNA Designer(WMD3)是一个专门应用于植物人工miRNA设计和前体序列设计的专业网站,其中利用重叠PCR法合成amiRNA前体序列,涉及多个PCR和纯化回收过程,步骤繁琐,周期较长。本研究利用WMD3设计了麻竹转录因子DlSCL6基因的人工miRNA序列和其前体序列,采用改进的重叠PCR方法,快速克隆获得了该前体序列,并以改造的pCMABIA1301载体为框架,构建了该前体的植物表达载体,为进一步研究利用amiRNA调控SCL6基因的表达奠定了基础。

利用amiRNA技术沉默矮牵牛查尔酮合成酶基因

转基因介导的基因沉默技术是进行基因功能分析和利用基因工程改良作物的重要手段。在植物中,amiRNA(artificial microRNA)是具有高度特异性的基因沉默技术。根据amiRNA设计的原则设计了用于沉默矮牵牛查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的amiRNA:amiRchs1,用拟南芥miR319a的前体作为表达amiRchs1的骨架,重叠PCR扩增,将天然miR319a序列替换成amiRchs1,合成的DNA片段置于35S启动子之后,转化导入矮牵牛。转基因植株花色变淡,花冠出现弥散的白色斑点或不规则的白色斑块,严重的几乎呈纯白色,花色素苷含量明显下降,CHS的mRNA含量明显降低,表明拟南芥miR319a的前体作为表达amiRNA的骨架在矮牵牛中可行,且能有效沉默结构基因。

amiRNA分子设计及其离体合成策略

详细介绍了基于WMD3(Web MicroRNA Designer 3)软件平台的amiRNA(artificial microRNA)分子自动设计方法及其离体合成策略。应用网络在线设计时,只需输入目的基因靶序列相关信息后便可获得候选amiRNA。根据选定的最佳amiRNA,可得到4条含有amiRNA以及载体中miRNA两侧序列的寡聚核苷酸序列。重叠延伸PCR合成策略可以以这4条序列以及根据质粒模板设计的A、B两段序列作为引物,扩增出目标amiRNA。同样尿嘧啶切除的策略也可合成amiRNA,但这些引物序列需做适当调整变动。此外,还介绍了基于特异引物退火的amiRNA合成策略,该策略可保证amiRNA分子能够一步PCR合成,合成后的amiRNA表达盒可通过合适的限制性位点被克隆至目的载体中的相应位点。可以预见,这种amiRNA分子设计的科学性与合成策略的精确性将会使amiRNAi技术在生物基因功能分析中发挥更加重要的作用,对生命科学研究产生深远的影响。

丹参转录因子基因SmMYC amiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为我国传统中药,其活性成分的药理作用广泛,尤其在防治心血管病药物中具有重要作用。丹参水溶性酚酸类物质合成途径由苯丙烷代谢和酪氨酸代谢共同参与而成。转录因子对植物次生代谢起着十分重要的调节作用。我们前期测序结果显示,SmMYC是一个丹参bHLH类转录因子,可能参与丹参酚酸类化合物生物合成的调控。本研究利用拟南芥miRNA319前体为模板骨架,通过over-lapping PCR技术构建旨在能对SmMYC进行特异性沉默的artifi cal miRNA(amiRNA)植物表达载体,命名为pCambia1302-amiR-SmMYC,并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其导入丹参。Real-time PCR结果显示,所得转化阳性株系中SmMYC的mRNA水平均呈现不同程度的下降,同时酚酸类代谢途径中相关酶基因的表达也表现为相应程度的下调;福林酚法检测结果显示,转化株系中总酚酸含量均低于同期的野生型丹参。以上实验结果初步显示丹参SmMYC可能作为一个重要的转录因子参与酚酸类活性物质的代谢调控,同时为进一步研究SmMYC在丹参酚酸类化合物生物合成中的调控功能奠定了基础。

多抗马铃薯病毒及类病毒的amiRNA双元表达载体的构建及遗传转化

马铃薯病毒及类病毒病害严重影响了中国马铃薯的生产。为了培育抗病毒及类病毒的马铃薯新材料,本研究采用人工miRNA(artificial microRNA,amiRNA)策略,以马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)与马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)编码沉默抑制子P25蛋白和HC-pro蛋白的基因为靶标,利用5'RACE技术对P25基因、HC-Pro基因潜在的剪切热点进行预测。再采用overlapping PCR技术,以拟南芥mi R159a前体为骨架,设计特异性引物,构建分别靶向P25和HC-Pro基因的amiRNA表达载体。同时构建靶向马铃薯内源基因Virp1的amiRNA表达载体,将构建完成的三个amiRNA表达载体串联获得amiRNAs三联体,分别转入根癌农杆菌菌株EHA105,并用农杆菌介导法转化马铃薯品种克新13。经PCR鉴定,结果表明,目的基因片段已成功转入马铃薯中。

针对乙肝病毒的串联序列amiRNA表达载体的构建

目的为优化RNA干扰研究方法,构建了针对乙肝病毒的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体。方法设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列,构建单一序列amiRNA质粒表达载体;将其中干扰效率好的两个序列串联起来,构建串联序列amiRNA质粒表达载体。结果经酶切及测序鉴定,插入序列与靶序列一致,载体构建正确。结论成功构建了新型针对乙肝病毒的串联序列amiRNA质粒表达载体,为进一步体外及体内实验奠定了基础。

大豆gma-miR1510a生物信息学分析及人工microRNA植物表达载体构建

Micro RNAs(mi RNAs)是最近发现的一类广泛存在的内生的小RNAs,在转录水平负调控基因的表达。本研究采用生物信息学方法分析gma-mi R1510a的靶基因和启动子中的顺式作用元件。PLACE和Plant CARE启动子数据库分析表明gma-mi R1510a启动子具有一些参与非生物胁迫、植物激素、组织特异表达和光应答元件。PMRD软件预测获得9个gma-mi R1510a靶基因,属于抗病蛋白和ATP结合家族成员。通过重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有ami R1510a前体的植物表达载体ami R1510a-p CAMBIA3301。

抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展

本文从选育和利用抗(耐)柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的柑橘品种和砧木、弱毒株交叉保护、转基因诱导的CTV抗性等方面综述抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展,并就人工miRNA(artificalmicroRNA,amiRNA)介导抗性加以展望,旨在为更好地控制CTV危害提供借鉴。

大豆gma-miR1514b生物信息学分析及人工microRNA植物表达载体构建

MicroRNAs在植物发育与逆境响应等多个方面具有重要的调节作用。本研究采用生物信息学方法分析gmamiR1514b的靶基因和启动子中的顺式作用元件。PLACE和Plant CARE启动子在线预测工具分析表明gma-miR1514b启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和一些参与光、逆境和植物激素应答相关的顺式作用元件。PMRD软件预测获得5个gma-miR1514b靶基因,分别与拟南芥CA2、NTL9和ANAC014基因同源。通过重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiR1514b前体的植物表达载体amiR1514b-p CAMBIA3301。

植物MicroRNA介导的基因调控在作物改良中的应用潜能

植物Micro RNAs(mi RNAs)是长度约22个核苷酸的內源、单链、非编码、小分子RNA,通过降解或抑制靶m RNA介导转录后沉默。随着高通量测序技术及各种研究技术的进步,越来越多的micro RNA被测序和验证,为利用基因工程手段进行作物改良提供了丰富的候选基因资源。综述了mi RNAs在生物胁迫、非生物胁迫和植物生长发育等方面的最新研究进展,同时分析了mi RNAs介导的基因调控在作物改良中的应用潜能,并介绍了几种基于mi RNA作用机制的植物基因工程改良作物的转基因新技术,如靶基因RNAi,人工mi RNAs(ami RNAs),Target Mimics(TM),超表达mi RNA-resistant tagerts;也讨论了基于mi RNA作用机制的转基因技术所面临的风险和挑战。

Artificial miRNA调控甘蓝型油菜芥酸的研究

芥酸是重要的工业原料,主要来源是甘蓝型油菜种子,为调节甘蓝型油菜种子内芥酸含量,针对甘蓝型油菜芥酸合成过程中的关键酶基因Bnfad2设计特异性amiRNA,并构建种子特异表达载体,转化高芥酸甘蓝型油菜品种MY15和低芥酸甘蓝型油菜品种LEA01,并对转化植株T_0种子脂肪酸进行分析。结果表明,转化的高芥酸甘蓝型油菜芥酸的增加最高达到5.12%,最低2.11%;而转化的低芥酸品种,最高仅为0.45%,最低只有0.16%,而且所有转化低芥酸材料的芥酸含量都小于1%;同时转化种子内油酸的含量得到了明显的提高,最低为4.99%,最高达到了10.71%,亚油酸降低的幅度十分明显,最大降幅达到17%。表明amiRNA技术可以通过影响脂肪酸合成过程中特定基因的表达,有效改变种子内脂肪酸的组成,从而改变其营养结构,提高营养价值,进一步提高油菜种子的附加值。本研究为运用amiRNA技术调节油菜脂肪酸组成和改变其营养结构提供了一定理论依据。