Determination of 18 Kinds of Amino Acids in Fresh Tea Leaves by HPLC Coupled with Pre-column Derivatization

A rapid and accurate quantitative method of high performance liquid chromatography( HPLC) with fluorescence detector has been developed for the analysis of 18 kinds of amino acids in fresh tea leaves. The samples were minced and mixed,and extracted with ultra pure water at 90℃ for 20 min. The 6-aminoquinolyl N-hydroxy-succinimidyl carbamate( AQC) was used as pre-column derivatization reagent. Gradient HPLC separation was performed on a C_(18) column( Symmetry C_(18),3. 9 mm × 15 cm,4 μm). Good linearity between concentrations and peak areas was achieved in the concentration range of 5. 0-250 μmol/L for 18 kinds of amino acids. The method was validated by the analysis of five replicates. The 18 kinds of amino acid standards were spiked in fresh tea leaf samples and the average recovery rate was 86. 25%-109. 05% with relative standard deviations( n = 5) ranging from 6. 03% to 10. 56%. The limit of detection( LOD) for the analytes was0. 05-1. 27 μmol/L. The method was successfully applied to the analysis of the 18 kinds of amino acids in fresh tea leaves from east Dongting and west Dongting mountains in Suzhou. The results indicate that the method is simple,rapid,precise and reliable.

不同采收期枇杷叶中氨基酸的组成与分析

目的 对12个月份采收期枇杷叶的氨基酸成分组成及含量变化进行分析,为确定枇杷叶采收期及资源利用提供理论依据。方法 采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法测定不同月份枇杷叶氨基酸组成及含量;采用SPSS22.0版软件进行数据统计学差异及相关性分析;根据世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)提出的理想模式及朱圣陶提出的氨基酸比值系数法,对不同采收期的枇杷叶氨基酸进行评分。结果 不同采收期枇杷叶中均含有17种氨基酸,7种人体必需氨基酸(EAA)、9种儿童必需氨基酸(CEAA)及9种药用氨基酸。17种氨基酸分别是天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸,它们的平均含量分别为3.41~7.23、4.64~9.66、2.05~3.75、2.99~4.95、0.01~1.56、2.33~4.85、2.10~4.03、2.67~5.48、5.37~7.64、1.45~3.49、2.70~5.53、0.01~0.48、3.64~4.78、1.91~4.15、3.96~7.83、2.39~4.60、1.85~3.65 mg·g^(-1)。不同采收期枇杷叶中17种氨基酸、总氨基酸(TFAA)、EAA总量、CEAA总量、药用氨基酸、苦味氨基酸的含量间差异有统计学意义(P<0.05);苦味氨基酸在总氨基酸中的百分含量较稳定。不同采收期枇杷叶的EAA含量为44.26%~50.33%,明显高于WHO/FAO模式值(35.00%);EAA/非必需氨基酸(NEAA)均值(55.67%)和EAA/TFAA均值(35.74%)分别接近WHO/FAO模式值的60%、40%;不同采收期枇杷叶的17种氨基酸含量峰值前2位是7月和11月;氨基酸比值系数分(SRC)值为62.53~76.17,前3位为11月、8月及7月。赖氨酸为枇杷叶的第一限制氨基酸。苦味氨基酸与药用氨基酸、TFAA呈正相关(P<0.01)。结论 枇杷叶中氨基酸种类齐全,组成合理,具有较佳开发利用价值;不同月份氨基酸的含量差异大,7月和11月是枇杷叶氨基酸合理开发利用的较佳时期。

柱前衍生高效液相荧光检测法测定复方氨基酸注射液中甲硫氨酸亚砜的含量

目的建立测定复方氨基酸注射液中甲硫氨酸亚砜质量分数的高效液相色谱法。方法采用柱前衍生HPLCFLD法,色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(3.0 mm×100 mm,2.7μm)或效能相当的色谱柱,以乙酸钠四氢呋喃溶液为流动相A,乙酸钠溶液-乙腈-甲醇(体积比20∶40∶40)为流动相B,流速为1.0 mL/min,采用荧光检测器,激发波长为233 nm,发射波长为441 nm。结果甲硫氨酸亚砜质量浓度在0.02605~2.605μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9996),检测限为1.3×10^(-3)ng,平均回收率为100.1%,RSD为0.3%。结论建立的方法操作简单、准确、灵敏度高,适用于复方氨基酸注射液中甲硫氨酸亚砜的测定。

AQC柱前衍生高效液相色谱方法测定康复新液中游离氨基酸和总肽的含量

目的应用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生化技术,建立康复新液中游离氨基酸和总肽的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法,并以总肽含量为指标对市售样品进行检测。方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5 C18色谱柱);60%乙腈(A)-0.14 mol·L^(-1)三水合乙酸钠溶液,用磷酸调节pH值至5.0(B)为流动相,梯度洗脱;柱温:39℃;流速:1.0 mL·min^(-1),检测波长:248 nm。结果14种氨基酸均能达到良好的分离效果;门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸分别在2.0~99.7、3.4~168.5、2.8~139.6、4.0~201.4、4.8~238.1、6.7~336.9、3.3~167.5、9.7~487.3、4.1~202.5、4.4~221.6、5.4~270.5、3.3~166.8、4.8~240.8、4.7~236.6μg·mL^(-1)范围内呈现良好的线性关系(r=0.9995~1.0000);游离氨基酸的平均加样回收率(n=6)为86.8%~108.1%,RSD为2.8%~4.4%,总肽酸水解氨基酸的平均加样回收率(n=6)为83.2%~102.7%,RSD为0.1%~3.1%;仪器精密度、重复性、稳定性实验的RSD均小于5.0%。结论该方法与现行质量标准的紫外分光光度法比较,二者测定的总氨基酸含量结果基本一致,但前者的专属性、重现性更优;以具有生物活性的总肽为质控指标,针对性更强,可为康复新液的质量评价提供更科学、合理的方法。

OPA柱前衍生化HPLC同时测定川红工夫红茶20种氨基酸含量

建立在线柱前衍生液相色谱法同时测定不同品种川红工夫红茶中的20种氨基酸含量,并评价其与滋味品质相关性。以邻苯二甲醛(OPA)为衍生试剂,利用液相色谱仪的自动进样器进行柱前衍生,采用Hypersil BDS C 18柱(150 mm×4.6 mm,3μm),以0.016 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=8.2)与甲醇-乙腈-水(4.5∶4.5∶1,V∶V∶V)组成流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温50℃,荧光检测器激发波长340 nm、发射波长450 nm;通过相关分析,比较不同滋味属性氨基酸含量与红茶滋味的相关性。结果表明:20种氨基酸在0.195~2.584μg/mL的范围内与各自峰面积呈良好的线性关系,其相关系数为0.9954~0.9999,检测限为0.006~0.036μg/mL,定量限为0.020~0.184μg/mL,加标回收率为90.40%~99.13%;除四川群体种红茶和梅占红茶中未检出组氨酸外,其余氨基酸均在5个品种红茶中检出,氨基酸总量27.33~65.29 mg/g之间,其中含量最高的是黄金芽红茶,氨基酸组分中,含量最高的是茶氨酸,然后是天冬氨酸和谷氨酸;红茶中的鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、氨基酸总量与红茶的鲜味、甜味和综合滋味评分呈显著或极显著正相关,对红茶滋味的鲜爽度和浓强度起着重要作用。采用OPA柱前衍生反相液相色谱荧光法检测氨基酸组分精密度和回收率高,具有成本低、快速、准确的特点,可用于红茶中20种氨基酸组分的快速测定。

柱前衍生-高效液相色谱法测定巴戟天中氨基酸含量及营养价值评价

建立柱前衍生-高效液相色谱法测定巴戟天中氨基酸含量,采用氨基酸比值系数法评价其营养价值。采用盐酸水解法制得巴戟天氨基酸供试品溶液,以异硫氰酸苯酯和三乙胺为柱前衍生化试剂,采用高效液相色谱法,使用Ultimate Amino Acid色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)以0.1 mol/L无水乙酸钠-乙腈为流动相,梯度洗脱,柱温40℃,检测波长为254 nm,测定氨基酸含量;通过氨基酸比值、氨基酸比值系数、氨基酸比值系数分等评价其营养价值,并采用系统聚类和主成分分析对其进行分类分析。结果表明,15种氨基酸线性关系良好,相关系数r≥0.9996。16份巴戟天氨基酸总含量为17.87~102.15 mg/g,均检测到15种氨基酸,其中包含6种必需氨基酸,占总氨基酸含量的14.15%~32.06%;8种药用氨基酸,占总氨基酸含量的45.20%~56.31%。限制氨基酸为苏氨酸和亮氨酸,氨基酸比值系数分为33.87~61.31。不同巴戟天样品氨基酸组成相关性显著;主成分分析提取2个主成分,累计方差贡献率为97.085%,可将16批巴戟天分为三类。该实验测定方法简单有效,可同时分离测定15种氨基酸,精密度与重复性良好,有较高的药用价值,可为巴戟天的品质分析和资源开发利用提供参考。

柱前衍生-高效液相色谱法测定化妆品中16种氨基酸的含量

提出了2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生-高效液相色谱法测定化妆品中甘氨酸、亮氨酸、组氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等16种氨基酸含量的方法。取化妆品样品5 g置于50 mL离心管中,加入5 mL水,超声10 min,加热煮沸15 min,冷却后加入15 mL 35 g·L^(−1)磺基水杨酸溶液,以转速10500 r·min^(−1)离心20 min。取全部上清液,用35 g·L^(−1)磺基水杨酸溶液定容至25 mL。取1 mL样品溶液,加入0.5 mol·L^(−1)碳酸氢钠溶液(pH 9.0)1 mL和1%(体积分数)DNFB衍生溶液1 mL,混匀,于60℃加热10 min,冷却后用0.01 mol·L^(−1)磷酸二氢钾溶液(pH 7.0)定容至5 mL,所得溶液中16种氨基酸经X Bridge C_(18)色谱柱分离,以不同体积比的含1%(体积分数)N,N-二甲基甲酰胺的0.05 mol·L^(−1)乙酸钠缓冲液(pH 6.5)-体积比1∶1的乙腈-水混合溶液为流动相进行梯度洗脱,在360 nm处检测。结果表明:16种氨基酸标准曲线的线性范围均为0.004~40.0 mg·L^(−1),检出限(3S/N)为0.1~0.2 mg·kg^(−1);对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,回收率为89.0%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均不大于10%。方法用于11种市售化妆品分析,检出的氨基酸成分多为组氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸。

不同产地及加热方式文冠果仁中的氨基酸成分分析

目的 分析不同产地的文冠果仁氨基酸成分及加热方式对氨基酸的影响。方法 采用ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),样品以异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化,以乙腈-甲醇-水(3∶1∶1)为流动相A,0.1 mol·L^(-1)的醋酸钠溶液(p H 6.5)-乙腈(93∶7)为流动相B,柱温35℃,检测波长254 nm。结果 17种氨基酸在1.806~225.200μg·m L^(-1)与峰面积呈良好的线性关系,各产地必需氨基酸、药用氨基酸、苦味氨基酸和儿童必需氨基酸占总氨基酸的含量分别为14.40%~18.99%、64.06%~73.79%、14.82%~17.09%、23.53%~29.30%,北方地区的文冠果仁氨基酸含量、必需氨基酸含量和药用氨基酸含量均比较高,文冠果仁经过加热处理后各类氨基酸均有所提高。结论 不同产地文冠果仁的氨基酸在含量和营养价值上具有差异,北方地区的文冠果仁氨基酸营养和药用价值较高,文冠果仁经过一定的加热后食用营养价值和药用价值得到提高。

柱前衍生-HPLC法测定天龙泉糯米调味酒中18种氨基酸

为满足企业对糯米调味酒精细化生产的品控需求,该研究利用反相色谱柱建立了测定天龙泉糯米调味酒中18种氨基酸的柱前衍生-高效液相色谱(HPLC)方法。通过优化洗脱梯度,使待测糯米调味酒的18种氨基酸色谱峰实现有效分离,确定最优色谱条件,进而建立了定量方法并对其进行方法学考察。结果表明,优化后的色谱条件为以异硫氰酸苯酯作为衍生试剂,乙腈∶水(4∶1,V/V)为流动相A,0.019 mol/L乙酸钠溶液(pH=6.2)为流动相B,梯度洗脱,柱温28℃,流速1 mL/min,检测波长245 nm。在各氨基酸标准曲线的线性范围内相关系数(R^(2))均≥0.998 7,平均加标回收率为92.38%~104.86%,相对标准偏差(RSD)≤4.45%,重复性、精密度试验结果RSD均<5%。该方法操作简单,准确高效,可定量测定天龙泉糯米调味酒及相关产品中各氨基酸的含量。

柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)中氨基酸的含量

目的建立复方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)的柱前衍生化含量分析方法。方法以邻苯二甲醛联合9-芴甲基氯甲酸酯(OPA-FMOC)进行在线衍生,采用Zorbax Eclipse-AAA柱,以40 mmol/L NaH_(2)PO_(4)溶液(pH7.8)为流动相A,乙腈-甲醇-水(45:45:10)为流动相B,梯度洗脱,检测波长338、262 nm,柱温40℃。结果各氨基酸之间分离度良好,线性相关系数均不小于0.9994,平均回收率99%~103%,重复性RSD均小于2%。结论该法稳定、准确、高效,可为复方氨基酸注射液的含量测定和质量评估提供参考,并首次报道了OPA-FMOC衍生分析法中赖氨酸峰面积重复性不佳的优化方法。

氨基柱高效液相色谱法检测大豆提取物中的磷脂酰胆碱

建立一种利用高效液相色谱检测大豆提取物中磷脂酰胆碱的简便方法。色谱柱为氨基色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相洗脱条件为20%(V/V)乙腈水溶液等度洗脱,检测波长为206 nm,流量为0.8 mL/min,以峰面积为指标进行定量分析。结果表明,磷脂酰胆碱的保留时间为5.292 min,峰面积与浓度之间线性关系良好,相关系数(r^(2))为0.9996;稳定性实验、精密度实验、加标回收率实验表明该方法准确、稳定、可靠。按照此方法检测得到,经无水乙醇提取的大豆提取物中磷脂酰胆碱的含量为16.31%。该方法简单、快速、准确,可丰富卵磷脂中磷脂酰胆碱的检测方法,为其高效检测提供参考。

HPLC柱前衍生法测定速溶型水解乳清蛋白粉中18种游离氨基酸含量

本文采用柱前衍生-高效液相色谱法同时测定速溶型水解乳清蛋白粉中18种游离氨基酸的含量。结果显示,各氨基酸色谱峰之间分离良好,18种氨基酸回归方程相关系数均在0.998以上,加标回收率在92.6%~107.4%,相对标准偏差小于5.0%。此方法可用于测定市售速溶型水解乳清蛋白含量,且较《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124-2016)操作更为简便,可取得良好的测定结果。

柱前衍生化RP-HPLC测定芜菁子中的12种游离氨基酸

目的采用柱前衍生化PR-HPLC测定芜菁子中的游离氨基酸。探讨芜菁子的药用价值,挖掘新疆的芜菁子资源。方法采用水中超声提取异硫氰酸苯酯柱前衍生化后,用HPLC法测定芜菁子中的氨基酸。结果芜菁子中含有苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、胱氨酸、色氨酸、异亮氨酸等12种游离氨基酸,其中人体必须氨基酸7种,约占总游离氨基酸的65.7%,12种氨基酸在45 min内可很好地分离,平均回收率为92.7%~98.2%。结论所建方法不需专门的氨基酸分析仪,操作简便、灵敏度高、准确可靠。芜菁子中氨基酸的种类齐全,含量丰富,具开发价值。

柱前衍生高效液相色谱法测定白菜及小麦中草甘膦残留量

运用荧光衍生试剂FMOC-Cl衍生草甘膦后,利用双聚合氨基柱HPLC测定了白菜及小麦中草甘膦的含量,该方法灵敏度高,可靠性强。通过试验,找到了最佳衍生条件和色谱条件。该方法通过测定蔬菜及小麦样品得到了确证,在添加草甘膦标样1mg/kg时,最低检出限为0.3mg/kg,平均回收率为82.4%,变异系数为10.3%。

柱前衍生化高效液相色谱法测定鳖甲生、制品中氨基酸的含量

目的：建立柱前衍生化高效液相色谱法分析鳖甲生、制品中氨基酸的组成和含量。方法：采用酸水解法制备鳖甲生、制品的氨基酸样品溶液,以邻苯二甲醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）为柱前衍生化试剂,采用C18色谱柱,梯度洗脱。结果：18种氨基酸在38 min内得到较好分离,在一定浓度范围内线性关系良好（r≥0.9991）,鳖甲生、制品中检出的16种氨基酸的平均加样回收率在90.43%~110.69%之间,RSD在0.76%~5.89%之间（n=6）。结论：该方法分离效果较好,可用于测定鳖甲生、制品的氨基酸含量。

美洲大蠊药材中氨基酸含量的柱前衍生化高效液相色谱法测定

目的建立HPLC法测定美洲大蠊药材中氨基酸含量的方法。方法用盐酸水解、邻苯二甲醛和β-巯基乙醇柱前衍生,0.50%磷酸二氢钠缓冲液(pH7.8)-甲醇-乙腈为流动相,柱温:35℃,检测波长:338 nm,梯度洗脱后测定氨基酸的含量。结果各氨基酸衍生物在40 min内均能得到良好的分离,r值为0.999～1.000 0(n=6),平均回收率为92.34%～103.9%,RSD为1.18%～4.76%。结论该方法简便、准确、重复性好,可作为美洲大蠊中氨基酸的含量测定。

粮食中氨基酸HPLC测定方法的研究

报道了用磺酰氯二甲胺偶氮苯（ＤＡＢＳ－ＣＬ）柱前衍生技术，通过反相ＨＰＬＣ定量测定食物中的氨基酸，并对衍生条件及测定条件进行探讨。该方法对标准面粉中１７种氨基酸含量进行测定，相对标准差小于１０％，加标测其回收率为８８．４％～１０６％。用同一样品经氨基酸分析仪和该方法比较测定值相符。

7种氨基醇类药物在替考拉宁柱上的对映体分离

在替考拉宁手性柱上对阿替洛尔、美托洛尔、富马酸比索洛尔、普萘洛尔、异丙肾上腺素、沙丁胺醇及拉贝洛尔7种氨基醇类药物进行了对映体分离的研究。考察了流动相甲醇中添加少量酸碱以及酸碱不同比例对7种溶质的对映体分离的影响。固定极性有机相甲醇中冰醋酸和三乙胺的比例为1∶1时,手性溶质的保留因子均随着流动相中冰醋酸/三乙胺含量的增加而减小,分离因子(α)基本保持不变,分离度减小。这可能是因为过量的酸增加了流动相的极性,使溶质较快被洗脱。在不加冰醋酸的情况下,除拉贝洛尔外,随着三乙胺浓度的增加,容量因子均减少,分离因子基本不变,分离度减小。这可能是因为三乙胺的增加使流动相的极性增加,溶质与手性固定相间的氢键减弱。结果表明:冰醋酸和三乙胺的比例并不影响手性分离的实质。

雌、雄地鳖中17种氨基酸的含量测定及指纹图谱研究

目的:建立地鳖17种游离氨基酸的HPLC-FLD指纹图谱,考察雌、雄地鳖中17种氨基酸成分的含量差异。方法:0.1 mol/L盐酸超声提取游离氨基酸,OPA为衍生试剂,Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相A为磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH=7.5),流动相B为甲醇-乙腈-水(45∶45∶10),梯度洗脱,FLD检测器激发波长340 nm,发射波长450 nm,流速1.0 m L/min,柱温30℃。结果:建立了地鳖中游离氨基酸HPLC指纹图谱,标定了21个共有峰,采用国家药典委员会"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"进行相似度评价,15批雌地鳖药材相似度均不低于0.97;定量分析了地鳖中17种氨基酸成分,不同批次地鳖样品中各氨基酸含量差异较大,湖北产较江苏、河北产总游离氨基酸含量高;地鳖雌虫与雄虫总游离氨基酸含量比较,雌虫显著高于雄虫。结论:所建立的地鳖指纹图谱准确、重复性好,可为地鳖质量控制标准的建立提供数据依据;地鳖雌、雄虫中17种氨基酸含量差异较大,为传统以地鳖雌虫入药提供新的科学依据。

HPLC-ELSD法测定人参茎叶皂苷胶囊中人参皂苷Rg_1、Re的含量

目的:建立人参茎叶皂苷胶囊中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定方法。方法:采用HPLC-ELSD法,Lichro-spher NH2分析柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(80∶20);蒸发光散射检测器漂移管温度为90℃,氮气为载气,流速为2.1 L.min-1。结果:人参皂苷Rg1在0.203～4.060μg,人参皂苷Re在0.212～4.240μg,进样质量的对数值与峰面积的对数值呈良好线性关系;制剂中两种成分的平均回收率分别为101.2%(RSD=2.5%)和100.7%(RSD=2.4%)。结论:该方法简便、准确,分离效果好,无干扰,可作为人参茎叶皂苷胶囊质量控制依据。