铜绿假单胞菌ampG基因的结构及其对耐药的影响

目的分析临床分离的铜绿假单胞菌ampG基因结构和功能及其在抗药性方面的影响。方法用VITEK 2Compact全自动微生物分析仪对细菌进行鉴定和药敏分析,对ampG基因全长引物扩增产物进行测序,将PAO1的ampG基因进行点突变实验,研究铜绿假单胞菌中ampG基因的结构与功能的关系。结果在189株PA中有166株测序成功,发现有84株在52个位点上发生了 112次碱基置换,其中C-T间的转换占51.8% (58次),G-A间的转换为25.0% (28次),其余为碱基颠换;在发生的52个位点突变中,有10个引起了氨基酸的改变;2个保守氨基酸(153和W90)基因定点突变时,当153突变为53S或53T (I53S或I53T)时,氨苄西林MIC水平大大下降,AmpC酶活性也明显下降,而W90突变时,氨苄西林的MIC和AmpC酶活性未见明显变化。结论铜绿假单胞菌ampG基因的突变率很高,但AmpG蛋白是稳定的,是维持AmpG正常功能所必需的,在细菌诱导表达β-内酰胺酶的过程中起到重要作用,说明其耐药机制更为复杂。

肺炎克雷伯菌 ampG 基因缺失突变株的构建

目的 利用同源重组技术构建肺炎克雷伯菌ampG基因缺失突变株,初步探讨ampG基因缺失对肺炎克雷伯菌AmpC酶诱导表达的影响. 方法 PCR分别扩增实验菌株ampG上下游同源臂片段,再利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR ,SOE-PCR）技术获得ampG基因上下游同源臂融合片段,酶切后克隆至温敏性自杀载体pKO3-km上,构建pKO3-km-ΔampG重组质粒,电转化至肺炎克雷伯菌Kp1和Kp NTUH-K2044 菌株中,通过同源重组技术,利用pKO3-km的温敏特点,筛选出肺炎克雷伯菌ampG基因缺失的突变株;将克隆质粒pACYC184-ampCR分别导入Kp NTUH-K2044的野生型及其ampG基因缺失菌株中,使其获得AmpC酶基因;采用纸片扩散法,以头孢西丁为诱导剂,观察ampG基因缺失前后对肺炎克雷伯菌AmpC酶诱导表达的影响. 结果 成功构建pKO3-km-ΔampG重组质粒,经PCR及DNA测序证实获得肺炎克雷伯菌ampG基因缺失突变株,与野生型相比,Kp1菌株ampG基因敲除后AmpC酶诱导表型消失,而在获得了外源性AmpC酶基因后, Kp NTUH-K2044菌株AmpC酶诱导表型阳性,其相应的ampG基因缺失株AmpC酶诱导表型阴性.结论 成功构建肺炎克雷伯菌ampG基因缺失突变株,ampG基因缺失后肺炎克雷伯菌AmpC酶不能诱导表达.