不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响

大曲是中国传统白酒典型的“多酶多菌”的发酵剂。免培养的分子生物学方法已经成为大曲微生物群落研究的常规方法。通过评估不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响,选择适合用于大曲DNA提取的最佳方法。该研究选择4种DNA提取方法分别对2种大曲进行大曲微生物DNA的提取,结合DNA提取质量、qPCR定量结果、细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因扩增子文库的Illumina Miseq测序结果,评估大曲基因组DNA不同提取方法的效果。从DNA得率和生物量的综合分析表明,SDS-based提取法的DNA得率高于试剂盒提取法,其中原位SDS-based提取法DNA得率高达5.46×10^(4)ng/g,但DNA纯度较低;SDS-based提取法的qPCR定量结果比试剂盒提取法高10^(1)~10^(6)量级,其中洗脱加SDS-based提取法的微生物生物量最高,比原位SDS-based提取法的生物量高10^(1)~10^(3)量级;试剂盒提取法的微生物生物量最低,细菌和真菌的生物量只有10^(2)~10^(4)copies/g。扩增子文库间Shannon多样性指数的比较结果表明,不同DNA提取方法在真菌ITS扩增子文库间存在显著差异,而在细菌16S rDNA扩增子文库间差异不显著。洗脱处理样本的真菌扩增子文库Shannon指数要高于原位处理的样本。通过对扩增子文库间存在显著性差异操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的比较可以看出,在细菌16S rDNA扩增子文库中,多数OTUs存在丰度差异,但它们大多数能在不同DNA提取方法中检测到;然而在真菌ITS扩增子文库间,少数OTUs在不同DNA提取方法中检测不到,说明DNA提取方法对部分真菌微生物基因组的提取存在显著影响,且洗脱处理有利于真菌基因组DNA的提取。综合对比4种DNA提取方法,洗脱加SDS-based提取法最适合用于大曲微生物的定量和群落结构分析。

不同生态环境下银中杨内生菌群落结构及生态位变异

【目的】研究生长在3个不同地点的银中杨根和茎中内生细菌和真菌的多样性,为植物和微生物互作研究提供参考。【方法】分别在黑龙江省大庆市林源镇常围子村、齐齐哈尔市错海林场和北京市房山区韩村河东营苗圃,取银中杨根和茎,表面消毒后,提取微生物DNA,通过16S rRNA和内部转录间隔区(ITS)扩增子IlluminaMiSeq测序以确定内生细菌和真菌群落的多样性。【结果】测序结果根据97%的序列相似性水平,将细菌和真菌的reads分别归类为1541和240个OTU。与数据库比对后确定银中杨内生细菌群落主要以放线菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、γ-变形菌纲和拟杆菌纲为主,内生真菌群落主要以座囊菌纲、伞菌纲、子囊菌纲、和银耳纲为主。α多样性和β多样性结果表明,北京、大庆和齐齐哈尔3个地点银中杨的茎内生菌群落明显聚集;而根内生菌群落表现出依赖于植物器官和生长环境的现象。Mantel检验结果表明,pH值、土壤有机质(SOM)含量和钾(K)含量与杨树根内生菌群落显著相关(P<0.05);而氮(N)、磷(P)含量并不是解释银中杨根内生菌群落差异的重要因素。由此确定不同生态环境下生长的银中杨不同器官中的核心微生物,共获得23个核心细菌OTU,归属于6个纲;22个核心真菌OTU,归属于7个纲。还可确定7个根内生细菌指示OTU:Actinophytocola、游动放线菌属、假诺卡氏菌属、红微菌属、链霉菌属、贪噬菌属和慢生根瘤菌属;5个茎内生细菌指示OTU:双歧杆菌属、红球菌属、小杆菌属、粪杆菌属和微球菌属。2个根内生真菌指示OTU:小球腔菌属和Ilyonectria;3个茎内生真菌指示OTU:格孢腔目、链格孢属和Endosporium。UpSetR结果表明:内生细菌中有51(3.30%)个OTU被6组样本共有,6个组单独特有的OTU占总OTU数的4.54%~15.44%;内生真菌中有1(0.42%)个OTU被6组样本共有,6个组单独特有的OTU占了总OTU数的2.92%~29.17%。【结论】银中杨根内生细菌和真菌群落结构取决于栽植环境中土壤的pH值、有机质含量和钾含量。不同植物器官可代表内生菌群落的独特生态位。本研究可确定与银中杨不同器官和不同生长环境条件相关的指示OTU和核心微生物。