藜麦CqANS基因的克隆及表达分析

【目的】通过藜麦ANS基因生物信息学分析,研究其蛋白相关特性,为进一步阐明藜麦CqANS基因发挥作用的分子机制提供基础。【方法】通过PCR反应克隆藜麦ANS基因(CqANS)的cDNA全长序列,进而对CqANS编码的蛋白质序列及特征进行预测分析,同时利用实时定量PCR对该基因在不同胁迫处理下的表达进行分析。【结果】藜麦ANS基因包含2个外显子和1个内含子,其编码的蛋白质编码359个氨基酸残基;藜麦CqANS蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,蛋白质定位于细胞质;其属于PLN03178超家族,具有典型的Fe2+-依赖的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy)的保守结构域。启动子分析显示在CqANS上游启动子区域存在多种响应非生物胁迫的顺式作用元件。低温胁迫诱导CqANS的表达,而外源ABA处理及干旱处理则抑制CqANS的表达。CqANS与包括AUR62014624-RA在内的多个蛋白存在互作关系。【结论】藜麦ANS基因(CqANS)具有ANS基因家族特征,可能与其他植物的ANS基因存在相似的生物学功能。

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶(ANS)是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱(Waters UPLC-Qtof)技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体(pET-28a)上,并在大肠杆菌(BL21)中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱(HPLC)检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1350 bp,开放阅读框(ORF)序列1074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官(根、茎和叶)中均表达。不同花发育时期RhANS表达量与花青素含量呈上升趋势;通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达出大小约为40 kDa的蛋白,与理论值相近。高效液相色谱仪(HPLC)检测表明,目的蛋白具有ANS酶活性。本研究为杜鹃花中花青素生物合成的分子调控机理提供了理论依据。

三华李ANS基因克隆及其在果实采后转色过程中的表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是参与植物组织花青素合成的关键酶。果肉富含花青素是三华李果实的显著特色。本研究首次克隆得到三华李ANS全长cDNA,将其命名为PsANS,并对其在不同组织和果实成熟转色过程中的表达模式进行分析。结果表明,PsANS编码区长度为1074 bp,包含一个长度为217 bp的内含子,可编码一个包含357个氨基酸、分子量为40401.37的蛋白质;该蛋白二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主,亚细胞定位于细胞质中。蛋白互作预测发现,含有ANS结构域的蛋白主要与TT4、DFR、UF3GT、F3H、TT8等存在互作关系。不同植物的ANS蛋白同源性较高,均包含相似的蛋白催化位点;PsANS与同属蔷薇科的欧洲李ANS蛋白的亲缘关系较近。PsANS在不同组织中表达差异较大,果肉中表达量最高。三华李后熟转色过程中PsANS表达呈上升趋势,乙烯处理进一步上调了PsANS的表达,表明PsANS对三华李果实发育和后熟过程中花青素的合成起着重要作用。

滇牡丹PdANS的克隆、表达及与花青素含量的相关性

花色是观赏植物最重要的品质性状之一,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。探明滇牡丹的花色调控机理,为提高观赏价值奠定理论基础。以花瓣为材料,克隆获得PdANS,生物信息学分析其特征,结合实时荧光定量PCR、HPLC等技术探究不同组织、不同发育时期中PdANS的表达情况与各组织花青素含量的相关性。结果表明,PdANS全长1 121 bp,包含一个1 064bp的开放阅读框(ORF),编码354个氨基酸,相对分子质量40.41 kD,理论等电点(pI)5.48,分子式为C_(1819)H_(2876)N_(474)O_(540)S_(12),脂肪指数为88.64,不稳定指数(Ⅱ)为55.32,亲水平均数为-0.435,推测为不稳定的亲水蛋白。且无信号肽序列及跨膜螺旋区,是没有分泌功能的非跨膜蛋白。系统进化分析显示,滇牡丹PdANS与牡丹、芍药等植物的ANS蛋白亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,PdANS在花瓣、花药、萼片、苞片和花梗中均有表达,以花瓣中的表达量最高。HPLC结果表明,在不同组织提取液中,分别检测出Cy3G5G、Pn3G5G、Cy3G和Pn3G四种花青素,且花青素含量花瓣>花药>萼片>花梗>苞片。相关性分析表明,花青素含量与PdANS表达量呈极显著相关性。推测PdANS在滇牡丹花色的形成中扮演着重要角色,参与花青素物质的生物合成。

不同花色油菜ANS基因的克隆及表达分析

在克隆5种不同花色油菜材料中ANS基因的基础上,对克隆的ANS基因序列进行了比较,对ANS基因不同拷贝cD-NA全长做了半定量PCR分析。结果显示,ANS基因的BnaA01g12530D和BnaC01g14310D拷贝在不同花色油菜中的序列和参考序列完全一致,并且在不同花色油菜花瓣中的表达也未见明显差异,而BnaA03g45610D和BnaC07g37670D拷贝在不同花色油菜中则呈现出序列多样性,并且其在红色和橙色油菜材料花瓣中的表达量与其他花色油菜相比差异明显。

云南安宁磷矿区水系沉积物磷赋存形态及分布特征

磷污染是水污染的重要组成部分,因其可造成水体富营养化、水质下降,从而引起人们的广泛关注。研究沉积物中不同磷赋存形态及其分布特征有助于了解沉积物中磷的行为特征及迁移能力,从而为水体富营养化防治提供支撑。磷矿的开采、冶炼对矿区内水资源环境可能产生严重影响,本文以安宁磷矿区内河流、水库为研究区域,分析了不同水系沉积物磷元素赋存形态及分布特征,并对其生态风险进行评估。采用X射线荧光光谱法测定研究区水系沉积物总磷(TP)含量,并基于顺序提取及Hupfer改进的磷形态分析方法,将研究区各水系沉积物中磷分为弱吸附态磷(NH4Cl-P)、可还原态磷(BD-P)、金属氧化物结合态磷(NaOH-P)、钙结合态磷(Ca-P)、残渣态磷(Res-P)等5种形态,采用单因子污染指数法对其进行生态风险评估。结果表明:研究区水系沉积物样品中TP含量范围为567.6~48115.5mg/kg,NH4Cl-P含量范围为0.07~115.2mg/kg,BD-P含量范围为8.84~802.5mg/kg,NaOH-P含量范围为21.3~3129.5mg/kg,Ca-P含量范围为12~45098mg/kg,Res-P含量范围为28.5~515.4mg/kg。研究区各水系沉积物样品磷形态具有相似的分布特征,即磷主要以Ca-P和NaOH-P形态存在,其他磷形态的相对含量大小顺序为NH4Cl-P<BD-P<Res-P。单因子污染指数评价结果表明,各水系沉积物中磷以重度污染为主。生物有效磷(BAP)污染评价结果表明,各水系沉积物中磷污染程度有所降低,但河流沉积物中磷仍以重度污染为主,磷释放风险较大,建议加强对磷矿区河流磷污染的监测与评估。

深部煤层原位保压保瓦斯取心技术装备及初步应用

深部煤层瓦斯含量精准测定是矿井瓦斯灾害防治和煤层气高效开发利用的基本前提。煤层传统取心技术普遍采用开放式取心,需利用估算方法获得煤层取心过程中的瓦斯损失量,难以保证煤层瓦斯原位参数的准确性和有效性。基于“原位保真取心”学术思想,开发了深部煤层原位保压保瓦斯取心技术,研制了深部煤矿原位保压保瓦斯取心器,并基于三维数值仿真对取心器外管、保压舱体结构与关键薄弱部件进行了强度校核。同时,依托自主研发的保压取心实验室模拟测试平台,测定并分析了保压控制器的保压能力,通过煤矿现场试验验证了取心器的可靠性。研究结果表明:自主研制的取心器具有保压能力强、保压时间长、防扰动性能稳定等优势;取心器在内部流体压力20 MPa和1000 N m扭矩作用下等效应力为121.1 MPa,远小于材料屈服强度,满足强度设计要求;取心器在20 MPa荷载作用下等效应力为63.9 MPa,满足强度设计要求;取心器整体在19.4 MPa压力条件内可持续稳定运行,可以满足大部分深部煤矿瓦斯测试需求;现场测试表明保压保瓦斯取心器的保压控制器闭合情况良好,现场取心率达100%。研究成果可为深部煤层瓦斯含量精准测定奠定理论、技术和装备基础,对于煤矿瓦斯灾害防治和煤层气勘探开发具有重要意义。

不同植物LDOX/ANS基因的生物信息学分析

花青素是一类重要的植物次生代谢产物。本文采用生物信息学的方法对已在GenBank上登录的拟南芥、西洋梨、苹果、桃、葡萄、芥菜、菊花新品种和水稻等植物的无色花青素双加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)基因的核酸及氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和推断。结果表明,ORF除了桃和菊花新品种为500bp左右之外,其它几种植物都在1070bp左右,分子量均为4kD左右,理论等电点均低于7,说明LDOX/ANS呈酸性。Glu、Leu和Val是这些植物共有的主要氨基酸。核苷酸同源性比对结果显示,拟南芥LDOX/ANS与其它植物LDOX/ANS的同源性较高;8个物种的LDOX/ANS基因被分为两个大类,单子叶植物水稻LDOX/ANS基因被单独分为一类,其它的均聚成一大类。研究还发现这些植物的LDOX/ANSN端不存在导肽和信号肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,包含一个20G-FeⅡOxy功能结构域。通过此次研究,希望为今后深入研究该类酶的功能和结构特征提供依据。

芒果ANS基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的c DNA长度为1 252 bp,开放阅读框的长度为1 056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。

山地城市暴雨洪水中人车失稳风险数值模拟研究

【目的】为定量分析山地城市暴雨内涝中行人和车辆的失稳风险特征,【方法】以重庆市悦来新城某排水片区为研究区域,构建一二维水文水动力耦合模型,对研究区不同降雨情景下的承灾体暴露性进行了模拟分析,按照最不利原则,从失稳风险范围和失稳持续时间等维度计算分析了典型人车(轿车、SUV、成人、儿童)的失稳风险。【结果】结果显示:降雨重现期越大,承灾体暴露性越高,失稳开始时间越早,持续时间越长,轿车的失稳风险最高,SUV次之,成人最小;四类承灾体在不同重现期下的轻微风险区域占比均最大,且其分布与积水深度较浅(如低于0.15 m)或流速值低于0.4 m/s的区域分布较为相似。【结论】结果表明:失稳风险等级越高的区域,其面临的洪水特征可能越复杂,尤其对于地形起伏多变的山地城市,应根据承灾体的特征进行风险图绘制,并结合降雨预报进行风险预警,提升灾害应急管理的精细化水平。

无先兆性偏头痛患者力敏腧穴分布规律及红外特征研究

目的:观察无先兆性偏头痛(MO)患者和健康受试者力敏腧穴体表分布情况,分析MO患者力敏腧穴分布规律及红外温度特征。方法:选取2019年12月至2022年3月就诊于江西中医药大学附属医院的60例MO患者和60例健康受试者作为研究对象,对120例研究对象进行体表力敏腧穴探查并记录,分析总结MO患者力敏腧穴分布与经脉、神经节段的位置关系;运用红外热成像技术(TTM)观察总结MO患者力敏腧穴红外特征。结果:MO组体表力敏腧穴出现率为88.3%(53/60),健康组为6.67%(4/60,P<0.01)。MO组力敏腧穴主要分布于胆经、肝经以及三焦经,率谷、风池、太冲穴区敏化率较高。MO组力敏腧穴多分布于三叉神经、C_(2)、C_(7)神经节段。力敏腧穴红外温度及部位特征表现为:MO患侧>MO健侧>健康受试者,MO患者颞部、目额部、后头部、前臂外侧、足背部力敏腧穴存在明显不规则热源分布。结论:MO患者力敏腧穴与传统经脉、神经节段位置密切相关,红外温度升高、体表不规则红外热源分布是其重要特征。

安宁河干旱河谷区不同类型农用地土壤抗冲性及与土壤性质关系

[目的]揭示安宁河干旱河谷区不同类型农用地土壤抗冲性变化特征,阐明影响安宁河干旱河谷区农用地土壤抗冲性的主要土壤因子,并进而为安宁河干旱河谷区农用地水土流失防治提供科学依据。[方法]以桉树经济林(EEF)、马铃薯耕地(PCL)、牧草地(GL)、撂荒地(AL)和青花椒园地(GPG)为研究对象,采用原状土水槽冲刷法进行土壤抗冲性试验,同时采集土壤样品测定土壤性质,对土壤抗冲系数与土壤性质进行Pearson相关性和逐步回归分析。[结果](1)在15 min冲刷过程中,径流含沙量随冲刷时间的延长,先急剧下降随后趋于平缓稳定;抗冲系数随冲刷时间的延长总体呈增长趋势,二者关系用对数、逆函数或线性函数拟合效果较好;选取的5种类型农用地土壤抗冲性表现为GL>EEF>GPG>AL>PCL。(2)农用地土壤性质主要受人类活动的影响,GL和EEF土壤性质优良,AL和PCL较差,GPG介于上述二者之间,团聚体稳定性表现为GPG>GL>EEF>AL>PCL。(3)相关性和逐步回归分析表明,土壤抗冲性主要受土壤机械组成和水稳性团聚体影响,最优回归方程为:土壤抗冲系数=84.016-1.135×<0.25 mm水稳性团聚体-7.413×黏粒。[结论]安宁河干旱河谷区耕地土壤资源受到耕作的严重危害,土壤质量严重下降,园地土壤抗冲性和土壤性质相对较差,应加强对耕地和园地资源的重视和保护。

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。

安宁烟区烤烟新品种筛选与评价

为筛选评价适宜安宁烟区生态条件种植的烤烟新品种,解决目前安宁烟区品种单一问题,在安宁烟区选择了8个烟草品种K326、云烟87、云烟121、云烟210、云烟218、YN222、YN227、YN228进行烟草品种筛选试验。对8个烟草品种的农艺性状、植物学性状、外观质量、形态特征、经济性状、抗病性进行综合分析。结果表明,YN222和YN227品种农艺性状和形态特征较好;外观质量颜色均优于对照云烟87,均厚于云烟87(CK)。YN222糖碱比适宜,吃香味较好;YN227产量显著高于各品种,且产值和均价均较高。YN222产值显著高于2个对照品种。在安宁烟区表现较好的烤烟品种是YN222和YN227,建议在安宁烟区推广种植。

龙眼花芽ANS基因的克隆与原核表达

运用蛋白质组学比较龙眼(Dimocarpus longan Lour.)正常成花和成花逆转花芽的蛋白质组变化,结果表明,ANS蛋白(anthocyanidin synthase)在龙眼成花逆转花芽中下调表达。应用RACE方法克隆ANS蛋白的全长cDNA,长度为1477 bp,包括1个1071 bp的开放阅读框,编码357 bp的氨基酸序列,GenBank的登录号为FJ479616(GI:218202927)。将ANS在大肠杆菌中表达,获得1个约46 kD的外源蛋白。这说明ANS蛋白在龙眼成花逆转过程中起作用。

不同肉质颜色萝卜ANS基因表达差异分析

为了解不同肉质颜色萝卜ANS基因的表达量与萝卜色素含量的关系,以16份不同肉质颜色萝卜为材料,采用荧光定量PCR法检测cDNA样本中的ANS基因表达量,同时测定萝卜肉质根的色素含量,分析萝卜色素含量与ANS基因表达量的相关关系。结果表明,16份不同肉质颜色萝卜间色素含量存在极显著差异(F=114.2940,P=0.0001)。其中,红皮红心萝卜肉质根色素含量(23.80‰)显著高于白皮白心萝卜色素含量(0.10‰);16份不同肉质颜色萝卜ANS基因表达量也存在极显著差异(F=95.9840,P=0.0001),其中,红皮红心萝卜ANS基因表达量最高(6.4390),白皮白心萝卜ANS基因表达量最低(0.1268)。相关分析结果表明,萝卜ANS基因表达量与萝卜色素含量的相关系数为0.83,且达到极显著水平。ANS基因可能是萝卜色素合成的关键结构基因。

[木奈]果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5'非编码区,267 bp 3'非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。

胰蛋白酶与ANS的相互作用

利用荧光光谱法研究了在不同ｐＨ、压力及不同浓度的脲作用时荧光探针１，８－ＡＮＳ（１－ａｎｉｌｉｏｎｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－８－ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）与胰蛋白酶的相互作用．发现在低ｐＨ时ＡＮＳ可以结合到胰蛋白酶上，其中以ｐＨ２．０、３．０时结合最强．进一步的研究发现脲变性对胰蛋白酶结合ＡＮＳ的能力有很大的影响：１．５ｍｏｌ／Ｌ的脲即可使得胰蛋白酶结合ＡＮＳ的能力大大降低，但有趣的是即使高达４ｍｏｌ／Ｌ的脲对胰蛋白酶色氨酸残基荧光也无明显影响．另外，在ｐＨ猝变、脲变性、及逐渐改变压力时，胰蛋白酶色氨酸残基荧光和结合到胰蛋白酶分子上的ＡＮＳ的荧光的变化大不相同．上述结果暗示胰蛋白酶的色氨酸残基所在的区域和其结合ＡＮＳ的区域是两个不相同的区域．

黑芥ANS基因的克隆和在芸薹属B基因组的PCR鉴别

利用同源克隆方法克隆黑芥ANS基因,获得2个ANS基因拷贝BnANS1和BnANS2,长度分别为1 366bp和1 367bp。这2个基因都有1个76bp的内含子。比较BnANS1和BnANS2基因序列,发现在编码区、5’与3’非编码区和内含子区域都有多态性,5’非编码区有3个碱基的多态性和4个碱基的缺失,编码区有26个碱基的多态性;内含子有2个碱基的多态性;3’非编码区有18个碱基的多态性和3个碱基的插入。这2个ANS拷贝都编码356个氨基酸的蛋白,具有其他物种同样的ANS蛋白保守结构域,属于2OG-Fe(II)加氧酶超家族。BnANS1编码的蛋白质理论分子量为40 448.58Da,等电点为5.05;BnANS2编码的蛋白质理论分子量为40 468.52Da,等电点为5.04。比较这2个ANS基因拷贝编码的蛋白质序列,发现有9个多态性位点。这2个ANS拷贝在黑芥的种皮和胚中均检测到表达。获得了1对ANS引物,能从白菜、黑芥、甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中,用等位特异PCR方法特异识别来自芸薹属B基因组的ANS基因。

洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析

通过PCR方法对洋葱花青素合成酶基因(AcANS)上游启动子序列进行扩增,获得长度为1.8 kb和2.2 kb的两种片段,命名为ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明,克隆到的两个启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件,还含有与MYB转录因子结合的元件,以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。同时构建ANSPM1和ANSPM2驱动GUS报告基因的植物表达载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达分析,表明两个启动子均有活性。