Annexin A11 G38R及D40G突变通过降低蛋白稳定性引起肌萎缩侧索硬化症的发生

目的:探讨Annexin A11(ANXA11)G38R及D40G突变引起肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的发病机制。方法:构建编码ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白及ANXA11野生型蛋白真核表达载体p ANXA11-G38R-Flag,p ANXA11-D40G-Flag和p ANXA11-Flag;将其转染至HEK293细胞后,用放线菌酮分别处理0,2,4,8 h;收集蛋白采用Western印迹检测3种蛋白的含量变化情况,比较目标蛋白的半衰期;构建稳定表达ANXA11 G38R,ANXA11D40G突变蛋白及ANXA11野生型蛋白的NSC-34细胞系,用Western印迹检测上述蛋白在NP-40裂解液中的溶解情况。结果:ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白的半衰期较野生型蛋白缩短(P<0.05),ANXA11 G38R蛋白和ANXA11 D40G蛋白半衰期无明显差异(P>0.05);ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白与ANXA11野生型蛋白在NP-40裂解液中均未发现不可溶成分。结论:G38R和D40G突变降低了ANXA11蛋白的稳定性;G38R和D40G突变不影响ANXA11蛋白在NP-40裂解液中的可溶性。

血清外泌体Annexin A11检测方法学构建及其在胰腺癌中的临床应用

目的探讨胰腺癌(PC)血清外泌体人膜联蛋白A11(ANXA11)的检测方法,初步评估ANXA11在PC中的临床应用价值。方法选择2016年12月至2019年7月南通大学附属医院确诊为PC、胰腺良性占位、胰腺炎患者的血清标本分别70例、15例、70例,选取同期健康体检者70名作为对照组。利用基于高分辨率、高精度质谱仪的平行反应监测(PRM)方法检测血清外泌体及无外泌体血清中ANXA11蛋白丰度。自建检测人血清外泌体ANXA11的点免疫印迹法(dot immunoblotting)并进行方法学评价;分析所有受试者血清外泌体ANXA11的水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)评价ANXA11、糖类抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)对PC的诊断效能;分析ANXA11与PC患者临床病理参数、疗效及预后生存期的关系。两组间比较采用Mann-Whitney U检验,四组间比较采用Kruskal-Wallis检验。结果自建的点免疫印迹法检测血清外泌体ANXA11具有较高的敏感度和重复性。利用构建的方法检测研究对象发现ANXA11在PC组升高最明显,与其余三组比较,差异有统计学意义(Hc=58.079,P<0.01)。ROC曲线表明,ANXA11(AUC=0.836)对PC的诊断效能高于CEA(AUC=0.656),与CA19-9(AUC=0.870)相当,联合CA19-9可提高诊断PC的敏感度,且保持较高的特异度。PC患者治疗前血清外泌体ANXA11水平与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤生长部位、淋巴结转移、远处转移及TNM分期均无关(Z值分别为0.052、-0.285、-0.402、0.324、0.888、0.658、1.734,P均>0.05),且PC患者术后第10天血清外泌体ANXA11水平与术前相比,差异无统计学意义(Z=-1.569,P=0.12)。PC患者生存时间与是否存在淋巴结转移、远处转移、TNM分期及治疗方式有关(χ^2分别为9.354、6.086、9.389、16.998,P均<0.05),而与ANXA11、CA19-9及CEA等无相关性(χ^2分别为1.516、0.011、0.159,P均>0.05)。结论本研究成功建立了检测人血清外泌体ANXA11的方法。血清外泌体ANXA11联合CA19-9可提高PC诊断敏感度。

p.G38R和p.D40G突变通过改变ANXA11蛋白亚细胞定位引发肌萎缩侧索硬化症

目的本研究旨在研究Annexin A11蛋白(ANXA11)N端突变p.G38R和p.D40G对该蛋白亚细胞定位的影响,探索其引起肌萎缩侧索硬化症(ALS)的机制。方法构建表达ANXA11野生型蛋白(wt)及p.G38R和p.D40G突变蛋白的真核表达载体,采用激光共聚焦显微镜检测3种蛋白在HEK293细胞中的亚定位。结果 ANXA11wt、p.G38R及p.D40 G蛋白均可在HEK 293细胞中形成囊泡状结构,其中p.G38 R组囊泡面积大于wt组(P=0.002)和p.D40 G组(P=0.006),后两组间无明显差异(P=0.791)。在单个细胞中,ANXA11 wt形成的囊泡数目大于p.G38 R组(P=0.002)和p.D40 G组(P<0.001),而p.G38 R组和p.D40 G组差异不明显(P=0.516)。与ANXA11 wt相比,p.G38 R蛋白(P<0.001)和p.D40 G蛋白(P<0.001)在细胞核内的分布显著减少,后两者间无明显差异(P=0.519)。结论 p.G38 R和p.D40 G突变减少了ANXA11蛋白相关囊泡状结构的数目和ANXA11蛋白在细胞核的分布,这可能是引起ALS发病的机制之一。

ANXA11基因突变致肌萎缩侧索硬化症合并额颞叶痴呆(附1例报告及文献复习)

目的报道膜联蛋白A11(ANXA11)基因突变所致肌萎缩侧索硬化(ALS)合并额颞叶痴呆(FTD)病例。方法收集1例ALS-FTD患者的临床表现、影像学检查等资料,并对先证者及其儿子行基因检测。结合文献复习收集ANXA11基因突变相关的ALS、FTD、ALS-FTD的临床研究,分析讨论ALS-FTD的临床特征。结果先证者为54岁女性,主要临床表现为进行性加重的构音障碍、失语、认知损害。头颅MRI示左侧颞叶局限性萎缩伴胶质增生。基因检测示先证者及其儿子ANXA11基因c.119位点A>G(p.D40G)杂合突变,临床疑诊ALS-FTD。结论ANXA11基因c.119A>G(p.D40G)突变患者多表现为单纯延髓麻痹,本例患者合并额颞叶痴呆,提示该基因位点突变也可导致认知损害。