脂质体介导抗猪瘟病毒基因转染猪胎儿成纤维细胞的条件优化

本研究以组织块法分离大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetus fibroblasts,PFF),通过脂质体将含有抗猪瘟病毒基因及绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组质粒转入猪胎儿成纤维细胞,探讨转染猪胎儿成纤维细胞的影响因素,如DNA质量、脂质体用量及转染时间。实验发现脂质体2.5uL、质粒1.2μg、转染时间6h时转染率最高,为32.5%。过量的脂质体、质粒及过长的转染时间(>6h)会引起细胞的皱缩及死亡。本研究旨在为构建抗猪瘟病毒转基因克隆猪提供核供体。

胶体金法与酶联免疫吸附测定法检测猪瘟抗体的比较

为比较胶体金法与ELISA法检测猪瘟抗体的符合率,以了解胶体金法的特异性与敏感度,用胶体金法和ELISA法平行检测受检猪血清标本猪瘟抗体滴度。结果表明,胶体金法和ELISA法检测猪瘟抗体的结果符合率为86.6%,胶体金法较ELISA法敏感度、特异度低,用胶体金法检测猪瘟抗体滴度存在一定程度的漏检率及误诊率,只能初步筛查猪瘟抗体。具有一定技术力量的县级兽医实验室使用ELISA法检测猪血样的猪瘟抗体滴度更为合适,对于胶体金法筛查阴性的猪血样,建议用ELISA法复检以防漏检。

茎环法RT-qPCR定量检测细胞抗猪瘟病毒siRNA的表达

RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8),成功地建立了最优的siN1和siN2的茎环法RT-qPCR检测方法。该方法表现出良好的特异性和较高的灵敏度,能检测出102至108个拷贝的siRNA,至少可达7个数量级的检测范围,平行性好(Rsq=0.999),扩增效率高(Eff.=98.2%)。茎环法RT-qPCR能准确地定量检测抗CSFV的PK-15细胞克隆的siN1/siN2表达水平,可结合常规的检测病毒水平的间接免疫荧光和TCID50等技术定量评价RNAi抗CSFV的有效性,为未来抗猪瘟转基因猪的抗病毒效果评价提供了先进的检测技术。

基于哺乳动物细胞表达系统的猪瘟基因工程E2亚单位疫苗动物免疫效果评价

猪瘟E2基因工程亚单位疫苗能诱导机体产生抗CSFV中和抗体,被认为是最具应用前景的新型猪瘟疫苗。本研究利用稳定表达重组CSFV E2蛋白的细胞系HEK-293T-E2,制备E2亚单位疫苗并在动物体内检测其免疫原性。结果显示,制备的E2亚单位疫苗能成功诱导试验兔和仔猪产生抗CSFV抗体,相比对照组,试验动物能够抵抗猪瘟标准强毒石门株的攻击,并且没有产生体温升高及其他不良反应,证实了该疫苗的有效性和安全性。本研究为新型猪瘟亚单位疫苗的研发提供了重要线索。