人Ⅳ型胶原蛋白提取及其单克隆抗体的制备与鉴定

从人胎盘提取Ⅳ型胶原（ＣＯＬⅣ）为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞融合，获得３株分泌抗ＣＯＬⅣ单克隆抗体的杂交瘤细胞。间接ＥＬＩＳＡ测定表明，３株ＭｃＡｂ与ＣＯＬⅣ有较强的反应，而与其它３种胶原及４种测试蛋白均无交叉反应。其中２株ＭｃＡｂ的亲和力都在１０（１１）以上。

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)_2与Fab′片段的抗肿瘤作用

目的研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)2、Fab′片段对小鼠肝癌22(H22)及小鼠Lewis癌肺转移的治疗作用。方法ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg/kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51·8%,F(ab′)210mg/kg为49·9%,Fab′20mg/kg为39·3%。F(ab′)2片段10mg/kg对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率为76%。结论抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠Lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。

Ⅳ型胶原放射免疫分析方法的建立及临床应用

采用单克隆技术制备鼠抗人Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）单克隆抗体,用氯胺-T方法标记,应用免疫竞争法建立Ⅳ-C放射免疫分析方法,其检测范围20μmg/L～500μmg/L。其方法通过特异性、精密度、准确性、亲和常数等实验方法学检验,表明Ⅳ-C放射免疫分析方法符合临床应用要求。应用该方法检测30例肝炎患者、15例肝硬化患者、35例Ⅱ型糖尿病（NIDDM）患者、25例甲亢患者,除NIDDM、甲亢患者外,其余患者血清浓度明显高于正常人（P<0.01）;NIDDM、甲亢患者Ⅳ-C血清浓度高于正常人（P<0.05）。结论Ⅳ-C血清浓度检测在肝病、肾病及相关疾病的研究中有一定的临床价值。

叶绿体细胞色素b6-f复合物中亚单位Ⅳ的小肽抗体的制备与鉴定

用人工合成的叶绿体细胞色素b_6-f复合物亚单位Ⅳ(17kD)中3个含10个氨基酸残基的小肽,分别与卵清蛋白偶联,经高压液相层析纯化后作为抗原去免疫家兔。获得抗17kD的3种单克隆抗体。蛋白质印渍术结果表明3个抗体均与17kD有免疫亲和反应。酶联免疫吸附测定表明,3种抗体均与菠菜类囊体膜有免疫亲和反应。因此这些抗体可用来作探测17kD在类囊体膜内、外两侧的分布及定位的探针。

抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素耦联方法的建立及测定

目的初步探讨金雀异黄素(genistein)与抗Ⅳ型胶原抗体耦联的方法。方法采用活性酯法将抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素进行耦联;采用凝胶层析对耦联物提纯;紫外吸收光谱法和Bradford蛋白检测法检测耦联物中的金雀异黄素与抗Ⅳ型胶原抗体的克分子比;免疫组织化学法检测耦联物与人晶状体囊膜结合的特异性。结果抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素成功耦联,耦联产物中抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素克分子比为1∶439,耦联物与晶状体囊膜可特异结合。结论采用活性酯法可成功地将抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素耦联,耦联物的免疫活性良好。

Ⅳ型胶原放射免疫分析方法的建立及临床应用

目的：应用单克隆技术制备鼠抗人ＩＶ型胶原（ＩＶ－Ｃ）单克隆抗体。用氯胺－Ｔ方法标记ＩＶ－Ｃ，应用免疫竞法建立ＩＶ－Ｃ放射免疫分析方法，其检测范围２０￣５００ｕｇ／Ｌ。方法和结果：通过特异性、精密度、准确性、亲和常数等实验方法学检验，表明ＩＶ－Ｃ放射免疫分析方法符合临床应用要求。应用该方法检测３０例肝炎患者、１５例肝硬化患者、３５例ＮＩＤＤＭ患者、２５例甲亢患者；除ＮＩＤＤＭ、甲亢外。

不同力达霉素与抗VI型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用

研究不同偶联方法制备的力达霉素(LDM)与抗IV型胶原酶单抗3G11免疫偶联物的选择性抗肿瘤作用。采用SPDP和SMBS作为偶联剂,将LDM辅基蛋白69位赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩修饰的单抗3G11连接,制备免疫偶联物;ELISA法测定偶联物的免疫活性,克隆形成法及人HT-1080细胞免疫缺陷小鼠移植模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,3G11-SMBS-LDM对体外培养的HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和3G11-SPDP-LDM。动物实验显示,LDM在等摩尔剂量条件下3G11-SMBS-LDM的抑瘤率为86.1%,游离的LDM组为71.2%,3G11-SPDP-LDM组为77.1%,3G11-SMBS-LDM的抑制作用显著增强。3G11-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为163.7%,3G11-SPDP-LDM组为125.3%,LDM组为71.9%,3G11-SMBS-LDM能显著延长荷瘤鼠的生存期,两个偶联物之间有显著性差异。3G11-SMBS-LDM偶联物更具有选择性抗肿瘤作用,疗效显著提高,荷瘤动物生存期延长,毒性明显降低,可能成为新的肿瘤治疗药物。

抗IV型胶原酶单抗与平阳霉素新型免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的考察抗IV型胶原酶单抗3G11与平阳霉素(PYM)偶联物的抗肿瘤作用。方法采用多聚谷氨酸(PLG)为中间载体制备3G11-PLG-PYM偶联物,MTT法测定其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以小鼠移植性肝癌H22为模型观察体内抗肿瘤作用。结果偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,对体外培养H22和KB细胞的杀伤作用弱于PYM。动物实验中PYM10mg·kg-1对H22肝癌的抑制率为60·6%,而等细胞毒性剂量的3G11-PLG-PYM偶联物抑瘤率达到90·8%,与PYM相比可显著延长小鼠的中位生存时间。结论3G11-PLG-PYM偶联物对小鼠肝癌H22的抑瘤作用比PYM强,可能成为新型的抗肿瘤靶向药物。

抗人Ⅳ型胶原单抗研制及其特性

本文用胃蛋白酶提取的人胎盘Ⅳ型胶原免疫Balb/c小鼠,免疫脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,经有限稀释法克隆获得两株分泌抗人Ⅳ型胶原单抗的杂交瘤细胞株CO_5和CO_6。用小鼠腹水和杂交瘤细胞培养上清纯化制备的两种单抗均属小鼠IgGl,K键,分别针对Ⅳ型胶原分子上的两个不同抗原决定簇。两种单抗特异性强,与人Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅷ型胶原、Ⅳ型胶原7S区及人白蛋白等相关蛋白无明显交叉反应,且单抗效价高,亲和力强。

基于黄芪甲苷单克隆抗体的ELISA检测方法的建立

目的建立黄芪甲苷的酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。方法以制备的黄芪甲苷单克隆抗体为基础,选择其最佳工作浓度,建立黄芪甲苷间接竞争ELISA法,并用该方法检测黄芪饮片中的黄芪甲苷含量。结果该方法线性范围为39～1 830 ng·mL^(-1),组内和组间差异均≤10%,平均加样回收率为102.7%(n=6)。采用该方法检测黄芪饮片中黄芪甲苷的含量,所得结果与HPLC法基本一致。结论建立了黄芪甲苷的ELISA检测方法,可为黄芪饮片及其制品的质量控制提供方法补充。

羊种布鲁菌VirB5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备羊种布鲁菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB5的单克隆抗体,为布鲁菌病的病原学诊断及研究提供基础。方法将纯化的VirB5蛋白以60μg/只的剂量对4只SPF级雌性BALB/c小鼠进行皮下注射免疫,以30μg/只的剂量每2周加强免疫1次,共3次;2周后,取小鼠眼眶静脉血测定抗体效价,再经腹腔注射进行第4次加强免疫;3d后,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按5∶1的比例进行融合。对融合的细胞进行3次细胞筛选及单克隆化,建立稳定分泌VirB5抗体的杂交瘤细胞株;对1只BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞腹腔注射,待小鼠腹部明显膨大时收集腹水并进行抗体效价测定。单克隆抗体免疫学特性鉴定分别采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹法。结果共建立6株能够分泌VirB5抗体的单克隆细胞株(2-2、2-12、2-19、2-25、2-31和2-40)。其中,细胞株2-19能够稳定分泌特异性识别VirB5纯化蛋白的抗体,经鉴定其分泌的VirB5抗体为IgG1亚型、κ轻链,单抗亲和常数为1.6×10^8,且腹腔注射细胞株2-19的小鼠腹水抗体效价为1∶51200。结论成功制备出布鲁菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB5的高亲和性单克隆抗体,抗体能够快速与病原菌表面蛋白特异性结合,为布鲁菌病病原学诊断方法的建立提供了一种备选材料。