抗牛血清IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清IgG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用含山羊血清的培养基培养细胞,上清用间接ELISA法筛选。获得4株能稳定分泌抗牛血清IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1G5、2A8、3F5、4C5。其中2A8为IgG2a,其余3株为IgG1;腹水单抗的ELISA滴度均超过10-5;除3F5株单抗与山羊血清有交叉反应外,1G5、2A8、4C5株与人、马、猪、羊、兔、豚鼠等血清均不发生交叉反应;4株单抗与制备病毒性疫苗的基质液呈阴性反应;4株单抗识别分子量为160kD的牛血清IgG的两个不同抗原表位;4株单抗相对亲和力大小依次为4C5>2A8>1G5>3F5,相对敏感度依次为2A8>4C5>3F5>1G5;4株杂交瘤细胞株的染色体计数均大于90条,连续培养三个月以及冷冻保存半年后复苏,细胞生长良好。使用这些单抗建立的双抗体夹心法检测生物制品中的残留牛血清IgG。

抗鸡IgG重链单克隆抗体的制备与应用

以提纯鸡IgG做抗原免疫Balb/c小鼠,取鼠细胞在-PEG_1000作用下与小鼠骨髓瘤细胞(Sp_2/o-Ag14)融合,采用间接免疫荧光(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清抗体,阳性孔经有限稀释法进行细胞克隆。共获得7株分泌抗鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞(2H_8、4D_8、1B_7、2A_7、2B_3、1G_12、3D_12),将这些细胞分别接种同系小鼠制备出腹水抗体,ELISA效价可达10~5～10~6,其中4株IFA效价为1∶400～1∶800,另3株为阴性。Ig亚类鉴定结果表明:除1G_12为lgG_(2a)外,其余均为IgG_1。经阻断试验、琼脂扩散试验和免疫印迹试验(Western blot)证明了单克隆抗体的特异性。上述杂交瘤细胞经3～6个月稳定传代后冻存于液氮中,1年后复苏培养,其分泌抗体的功能未见改变。

一种新的单克隆抗体检测方法在杂交瘤阳性细胞克隆筛选中的应用

目的探讨将一种新的检测抗人血清IgG及白蛋白单克隆抗体的方法应用在杂交瘤阳性细胞克隆筛选中。方法分别将人血清IgG和白蛋白连接到微球Beads上,混合2种微球,然后与抗人血清IgG及白蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,再与连接有荧光R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)的羊抗小鼠IgG抗体发生反应,最后在Luminex200仪器上读取微球上的平均荧光强度(MFI)值。结果抗人血清IgG及白蛋白单克隆抗体只与其相对应的微球发生特异性反应,2种抗体同时测定时,不互相干扰。当用该方法测定含有抗人血清IgG或白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液时,微球MFI值明显高于不含该抗体的上清液中微球的MFI值。结论该检测法具有较好的特异性,敏感性和重复性,可以应用到抗人血清IgG和白蛋白单克隆抗体杂交瘤阳性细胞克隆的筛选中。

牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立牛血清Ig G(bovine immunoglobulin G,BIg G)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用BIg G-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIg G单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度。应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIg G抗原残留量。结果建立了以3E12D2为包被单抗(8.0μg/ml,100μl/孔),4A2G1B1-HRP为酶标抗体(1∶1 000稀释,100μl/孔)定量检测BIg G的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3~9.6 ng/ml,R^2>0.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1%~108.5%之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均<10%;37℃放置3和6 d的稳定性均>90%;该试剂样品与BIg G可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应。9批牛血清中BIg G含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIg G均明显去除,但BIg G占牛血清残留量(BSA+BIg G)的比例却明显上升。结论建立的BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测。