KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

目的 :用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库。方法 :用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠 ,取其脾细胞 ,RT PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体 ,构建scFv文库 ,并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性。用KGla作为固相抗原 ,进行四轮吸附 洗脱 富集的筛选 ,SDS PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果 :文库的库容为 3× 10 6cfu ,单个克隆的BstN1Ⅰ酶切图谱显示多样 ,提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要 ,筛选后的文库能很好地表达外源scFv。结论

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定

目的 :构建表达抗PgpScFv,进行体外活性的测定。方法 :利用RT PCR方法 ,克隆抗Pgp杂交瘤细胞PHMAO2的重链可变区基因 (VH) ,轻链可变区基因 (VL) ,拼接为单链抗体 (ScFv) ,再克隆到具有强启动子的PET2 8a(+)载体上进行表达 ,并进行了表达产物体外活性的测定。结果 :构建了表达质粒PET2 8a(+) ScFvPGP。表达产物可与表达Pgp抗原的K5 6 2 A0 2细胞特异性结合 ,并不抑制Pgp外排泵的功能。结论 :构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能 ,并无抑制作用 ,因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能 ,无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂 ,均具有广泛的应用前景。

抗黄曲霉毒素B1单链抗体(scFv)库的建立和筛选

从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体细胞系中扩增到重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),经PCR将VH、Linker和VL连接成单链抗体(scFv),并克隆到载体pCANTAB-5E,经电转化大肠杆菌TG1,构建了库容量为1×108的单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到客容量为1×108的噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗-富集-扩增"4轮以后,得到针对AFB1特异性的噬菌体抗体。进一步以噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在细菌细胞周质中可溶性大量表达,最终经竞争ELISA分析表明获得了3株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1 scFv菌株,分别命名为3C3、3B3和4A2。

抗伊维菌素scFv蛋白质的变复性及纯化

基因工程技术的发展扩大了蛋白质研究领域,简化了研究步骤。原核表达系统表达目的蛋白质具有操作简单、培养周期短、高效经济、便于纯化等优点,但大部分表达的蛋白质是以包涵体的形式存在。包涵体是蛋白质在细胞内凝集形成的无活性不溶于水的固体颗粒,含有重组蛋白质及核糖体元件、内毒素、外膜蛋白质、RNA聚合酶和脂体等。

酵母展示筛选scFv方法的建立

目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GSLinker上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GSLinker的上下游,构建出重组质粒pYSD1。从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2。将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况。结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合。结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GSLinker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台。

基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立

目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。

新型小分子抗体scFv多聚体与肿瘤靶向

新型小分子抗体—单链可变区片段 (sc Fv)是由一弹性接头 (linker)将 VH和 VL 连接而成 ,是抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位。以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。依据接头的长度和 V区的方向 ,sc Fv分子可聚集形成二聚体 (Diabody)、三聚体 (tri-abody)和四聚体 (tetrabody)。我们就 sc Fv分子接头长度和 V区方向、sc Fv多聚体的表达和稳定性、sc Fv多聚体在体内的药代动力学、sc Fv多聚体的弹性和亲和力、鼠源性 sc Fv多聚体的体外应用、多特异性 Sc

抗人P185^(erbB2) scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞

目的将抗人P185erbB2scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC),通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。方法MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RT-PCR检测细胞穿孔素表达水平。结果HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%(P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%(P<0.01);CD25、LFA-1、FasL表达水平分别由3·99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%16.19%(P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高(P<0.01)。结论HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA-1/ICAM-1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。

抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化

在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3ScFv/抗PgPScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合。

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用.方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6.将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞.MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用.结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确.转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达.MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征.结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.

小鼠ScFv基因片段的构建

目的 利用分子重组技术构建小鼠单链抗体片段 (ScFv)。方法 采用PCR反应从小鼠脾细胞扩增鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区 ,利用连结引物将重链和轻链DNA组装成单链抗体 (ScFv)片段。结果 克隆出VH,VL 基因 ,用Linker将VH,VL 连接起来后的ScFv构建成功 ,其分子量为 75 0bp。结论 ScFv分子小 ,异源性低 ,可以结合与噬菌体载体中形成融合蛋白表达 ,该技术是抗体制备的一种简便、可靠的方法。

重组抗HER2 ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr-3细胞的促凋亡作用

目的:观察构建的重组抗HER2ScFv/tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用.方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游,转染SKBr-3细胞.间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达,MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.结果:转染SKBr-3细胞后,检测出目的蛋白的表达.MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制.间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达,并可观察到Cytc在细胞质中存在,SKBr-3细胞出现凋亡.结论:重组抗HER2ScFv/tBid分子可以在转染的SKBr-3细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤活性

目的研究抗Ⅳ胶原酶基因工程单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤效果。方法明胶酶谱法、Western-blot法研究顺铂对肿瘤细胞分泌Ⅳ胶原酶蛋白的影响,MTT法、实验动物肿瘤模型研究scFv (3G11)与顺铂联合在体外和体内试验中的抗肿瘤效果。结果顺铂可抑制肿瘤细胞分泌的Ⅳ胶原酶活性,scFv (3G11)与顺铂联合在体外试验中可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,体内试验中对小鼠移植性肝癌H22有显著的抑制作用,药物相互作用指数(CDI值)<1。结论scFv (3G11)和顺铂联合应用对肝癌的治疗有协同作用。

胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型ScFv的制备

目的制备胃癌单抗 MGd1的单链可变区片段 (single chain variable fragm ent,Sc Fv) ,为胃癌体内诊疗研究提供候选靶向载体分子。方法从 MGd1杂交瘤分离 m RNA,RT- PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因 (VH和 VL DNA) ,二者经 linker DNA连接形成 Sc Fv DNA。将 Sc Fv DNA与载体 p CANTAB5 E的连接产物转化于大肠杆菌 TG1,经 M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体 Sc Fv。以高表达 MGd1结合抗原的细胞株 KATO 对重组噬菌体抗体 Sc Fv进行两轮筛选后 ,随机挑取克隆经 EL ISA筛选 MGd1Sc Fv单克隆 ,并对其结合抗原的能力进行鉴定。结果 VH、VL 和 Sc Fv DNA分别约为 340、32 0和 75 0 bp。经两轮亲和筛选后 ,在随机筛检的 30个克隆中得到 12个噬菌体呈现型 MGd1Sc Fv单克隆 ,其中结合抗原能力强的克隆有 5个。结论用噬菌体呈现技术成功地获得了单抗 MGd1的 Sc Fv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。

抗肝癌单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40的构建及其导向作用的实验研究

目的构建单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40并探讨其导向细胞毒作用。方法采用亚克隆技术,首先将HAb25(scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子PE40,在p ly5载体上构建HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pBV220原核表达载体中,转化DH5α宿主菌,温度诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法;间接免疫荧光染色鉴定HAb25(scFv)-PE40与肝癌细胞结合的特异性;体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择性靶细胞杀伤活性。结果限制性酶切图谱和序列分析证实在p ly5载体上成功地构建了HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;该单链免疫毒素基因在pBV220载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的43.3%;纯化后的HAb25(scFv)-PE40间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特性;导向细胞毒实验结果显示HAb25(scFv)-PE40具有明确的选择性靶细胞杀伤活性。结论已成功构建和高效表达了单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40,该免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性(P<0.001),为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础。

二硫键稳定的抗肝癌人源化scFv-hTNFα突变体融合基因在大肠杆菌中表达

目的 提高抗肝癌抗体靶向人肿瘤坏死因子(hscFv2 5-hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,并探讨该新型靶向细胞因子在大肠杆菌中的可溶性表达。方法 以引物PCR法和重叠延伸PCR法 ,对人源化抗肝癌hscFv2 5及hTNFα基因进行定点突变 ,构建重组表达载体 pGEX -hFvT ,并以IPTG在大肠杆菌中诱导表达。用免疫组化染色和MTT比色法 ,分别检测重组蛋白的抗体和hTNFα突变体的双重活性。结果 重组基因在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。表达产物具有抗体和hTNFα突变体的双重活性 ,重组蛋白的稳定性得到大幅度提高 ,抗体活性于 4℃放置 3个月活性无明显下降 ,抗肿瘤活性较天然hTNFα高 4倍。结论 重组基因在大肠杆菌中获得了高效功能性表达 ;重组蛋白稳定性及抗肿瘤活性得到大幅度提高 。

全人源药用抗EGFR ScFv(HL-L-L)的构建、表达及抗肿瘤活性分析

目的对抗EGFR单克隆抗体重链可变区(VH)和轻链全长(L)经柔性肽链(linker)连接而成的单链抗体(VH-L-L)进行构建、表达及其抗肿瘤活性的分析,并对其进行生物信息学分析和相关谱学表征。方法通过OVER LAPING技术得到EGFR ScFv(HL-L-L)基因,然后构建原核表达载体pET-28a-c(+)-VH-L-L,经诱导表达、Ni柱纯化后得到目的蛋白HL-L-L,并对其利用SWISSMODEL进行三级结构预测;通过紫外扫描分光光度计,进行吸收波长的扫描;用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的粒度和电位;随后利用药理学方法,研究HL-L-L对乳腺癌细胞的增殖抑制情况。结果成功构建了原核表达载体pET-28a-c(+)-VH-L-L;获得了较高纯度的VH-L-L蛋白,并成功预测了其三维结构;其粒度约为489.7 nm,Zeta电势为-38.1,带负电;HL-L-L对MCF-7具有一定的增殖抑制作用,与空白组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功表达了全人源药用抗EGFR ScFv(HL-L-L),其对乳腺癌细胞的增殖抑制作用显著,为下一步研制抗EGFR的小分子抗体药物提供基础。