O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

本研究建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法,确立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型口蹄疫血清阴阳性判定标准:抗体效价大于或等于1∶32时判为O型口蹄疫抗体阳性;1∶16～1∶32时判为O型口蹄疫抗体可疑。检测131份阴性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和A型阳性血清,固相竞争ELISA方法和液相阻断ELISA方法的特异性分别是95.5%,84.7%。固相竞争ELISA方法检测口蹄疫亚洲1型、口蹄疫A型阳性血清时,无交叉反应,O型口蹄疫病毒感染牛、免疫牛和感染猪血清的阳性检出率均为100%,免疫猪检出率为86.7%。

以精子抗原肽为抗原的抗精子抗体ELISA检测方法的建立

目的建立组合多个精子抗原肽为抗原的检测抗精子抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)法。方法用PS3全自动多肽合成仪合成4个特异精子肽,并经反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化和质谱鉴定。用ELISA检测4个合成肽的抗原性,基于对这些合成肽抗原活性的评价,将4个精子抗原肽混合后(组合肽)作为抗精子抗体(AsAb)检测用抗原。结果合成了实验所需要的抗原性肽段,RP-HPLC结果显示纯度达95%以上。以组合肽为抗原建立的检测AsAb的间接ELISA方法,与商品化试剂盒相比符合率为95.6%。结论固相多肽合成技术可用于合成高纯度的精子抗原肽,以组合的精子抗原肽作为包被抗原建立的ELISA方法可提高AsAb检测的灵敏度。

监测口蹄疫抗体的液相阻断ELISA法的改进和体会

液相阻断ELISA(LBE)法由于具有高度的敏感性、特异性和重复性,目前被广泛应用于动物免疫抗体效果监测实践工作中,特别是为防控牛、羊亚洲I型口蹄疫(FMD)做出了积极的贡献。但该方法操作繁琐,稍有不慎就会导致实验结果发生偏差或试验失败,笔者就该方法应用于亚I型口蹄疫抗体检测中的改进和体会作一总结。

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。

A型口蹄疫抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为评价A型口蹄疫疫苗免疫水平,本研究以本实验室前期制备的口蹄疫病毒(FMDV)的单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 9A9作为检测抗体,建立了基于MAb的检测A型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法,并对其条件进行优化。结果显示,MAb 3D9的包被浓度为1.16μg/mL,A型FMDV抗原的最佳稀释度为1:5,HRP标记的MAb 9A9的最佳稀释度为1:5000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为35%。利用该方法分别检测A型、O型口蹄疫抗体阳性标准血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清。结果显示,除A型口蹄疫阳性标准血清为阳性结果外其余均为阴性结果,未出现交叉反应,表明本研究建立的方法特异性强。该方法对经病毒中和试验(VNT)检测为阳性的3份血清进行敏感性试验,敏感性分别为1:1024、1:256、1:128,均高于VNT,表明其敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。利用该方法与液相阻断ELISA方法(LPBE)和VNT对112份血清样品同时检测,分析三者相关性。结果显示,本实验建立的SPCE方法与二者的相关系数分别为0.901和0.916,表明该方法可靠性较好且与VNT的相关性更高。进一步利用本研究建立的SPCE方法和韩国Jeno A型FMDV ELISA抗体检测试剂盒同时检测470份临床血清样品(90份羊血清、170份牛血清和210份猪血清),结果显示该方法检测羊血清、牛血清和猪血清与Jeno试剂盒总体符合率分别为90.0%、91.8%和89.0%。表明该方法的检测结果较为准确。本研究为建立A型口蹄疫检测方法奠定了基础。

精子凝集试验、固相酶法和ELISA法检测不孕症夫妇血清抗精子抗体的分析

采用精子凝集试验、固相酶法和ELISA法对102对不明原因的不孕症夫妇进行了血清中的抗精子抗体检测。结果发现,不明原因的不孕症夫妇血清抗精子抗体阳性检出率为43.5％。明显地高于生育组(5.6％),P<0.01。三种检测方法中,ELISA 法敏感度较高,是检测抗精子抗体较为理想的方法。

口蹄疫病毒抗体SA-ELISA快速检测方法的建立

旨在解决如何对现有方法进行优化创新以建立口蹄疫抗体检测新方法的问题,本研究在基于原有液相阻断ELISA的基础上进行方法优化,实现口蹄疫病毒抗体的快速、灵敏检测。本研究通过对抗口蹄疫IgG抗体标记生物素技术与HRP标记链霉亲和素(HRP-SA)相结合建立新的液相阻断ELISA检测方法(SA-LPBE),在猪,牛、羊血清样品中具有较高的符合率。结合实际情况,判定优化后牛、羊血清抗体效价≥128,猪血清效价≥64时,判定为阳性,与商用检测试剂盒结果一致。并且经符合率分析,与原试剂盒具有92.3%的符合率,其批内变异系数<5%,批间变异系数<10%。该方法改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再标记HRP技术路线,根本上提高了酶促反应的效率,保证了方法原有敏感性的同时提高了方法的特异性;利用生物素标记抗体与HRP-SA反应迅速、标记原料稳定、检测背景值等优点实现了将液相阻断ELISA试剂盒操作时间由2 d缩短为3 h,解决了原有方法操作繁琐、用时过长、操作疲劳、不稳定、易出错等问题。建立的SA-LPBE可应用于FMDV抗体检测,为FMD流行和临床检测提供了技术方法。

应用ELISA方法判定口蹄疫疫苗毒株血清学相关关系

在液相阻断ELISA(LPB-E)体系中,用JMS毒株及OZK毒株滴定JMS阳性血清,计算OZK株对JMS株的r值分别为0.71,0.5,0.5,均介于0.4至1.0之间,说明对JMS株来讲,其阳性血清能够很好地中和OZK毒株抗原,能够对OZK毒株提供有效的免疫保护;用JMS毒株及OR毒株滴定JMS阳性血清,计算OR株对JMS株的r值分别为1和0.5,0.5,均介于0.4至1.0之间,说明对JMS株来讲,其阳性血清能够很好地中和OR毒株抗原,能够对OR毒株提供有效的免疫保护;用OZK毒株及JMS毒株滴定OZK阳性血清,计算JMS株对OZK株的r值分别为0.0625,0.0625,0.125,均小于0.2,说明对于OZK株来讲,其阳性血清不能很好地中和JMS毒株抗原,不能够对JMS毒株提供有效的免疫保护;用OZK毒株及OR毒株滴定OZK阳性血清,计算OR株对OZK株的r值均为0.5,介于0.4至1.0之间,说明对OZK株来讲,其阳性血清能够很好地中和OR毒株抗原,能够对OR毒株提供有效的免疫保护。

2种口蹄疫O型抗体阻断ELISA检测试剂盒应用比较

为评估2种常用口蹄疫O型抗体检测试剂盒的性能差异,对2020年春季随机抽检的3家规模养殖场提供的60份猪血清分别用液相阻断ELISA试剂盒和抗体阻断(固相)ELISA试剂盒进行了检测,并比较了2种试剂盒的阳性检出率和符合率。结果表明,2种方法检测结果总符合率为91.67%,符合程度高。在基层畜牧兽医部门日常定性检测中,推荐使用抗体阻断(固相)ELISA检测试剂盒。

精子肽的固相合成及应用初探

目的 :探讨将多肽固相合成技术用于检测抗精子抗体的ELISA试剂盒制备。方法 :以多肽固相合成法合成特异性精子肽 ,并经高效液相纯化分析及质谱分析。以此合成精子肽包板制备检测抗精子抗体的ELISA试剂盒 ,检测血清标本的AsAb。结果 :HPLC结果显示 ,合成的精子肽纯度达 98 2 6%;质谱分析结果主峰分子质量与理论值一致。采用合成多肽抗原建立了检测抗精子抗体的酶联免疫吸附测定方法 ;不明原因不育患者组与对照组间AsAb发生率呈非常显著差异(P <0 0 0 5 )。结论 :本固相合成法可获得高纯度特异性精子肽 ;该精子肽包板的ELISA试剂盒可靠简便。

仔猪O型口蹄疫母源抗体消长试验

[目的]为制定科学合理的仔猪口蹄疫免疫程序提供依据。[方法]以规模化养猪场和散养户中经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象,利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。[结果]仔猪通过母乳获得被动保护,在21日龄母源抗体达到高峰,规模化猪场和散养户母猪的平均效价分别达1∶142和1∶89。规模化猪场场仔猪21-30日龄保护率在80%以上,45日龄下降到65%,60日龄时基本无保护;而农户仔猪21日龄保护率为60%左右,30日龄仅为40%左右。农户饲养母猪免疫抗体水平远低于规模化猪场。[结论]对规模化猪场的仔猪进行口蹄疫疫苗的最佳首免时间为45-50日龄,而对散养户仔猪的最佳首免时间应为30日龄左右。

仔猪口蹄疫母源抗体消长规律监测

在贵阳某规模化养猪场,随机选取20头仔猪,采用正向间接血凝试验(IHA)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)两种血清学方法,对O型口蹄疫母源抗体的消长规律进行监测和分析。结果表明,13日龄左右抗体效价最高,IHA、LPB-ELISA监测的抗体平均效价分别是2.76、2.74,母源抗体免疫合格率分别为90%、85%,在23日龄左右平均效价均为为2.45,母源抗体免疫合格率均为75%,大部分仔猪仍被母源抗体保护,随着日龄的增加,抗体效价呈明显的线性下降,到36日龄左右抗体平均效价分别是1.98、1.95,母源抗体免疫合格率均为55%,45%的仔猪抗体效价低于保护临界值。因此,36日龄确定为仔猪首次免疫时间。两种方法监测的结果无显著差异(P>0.05)。

人精子蛋白17抗原肽的合成及其在抗精子抗体检测中的应用研究

目的:合成人精子蛋白17的线性B细胞表位肽(118-127aa),并以此为抗原建立抗精子抗体(AsAb)检测的ELISA方法。方法:用PS3全自动多肽合成仪合成人精子蛋白17抗原肽,并经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定。该合成肽作为ELISA法的包被抗原来检测血清中的AsAb(IgG)。结果:合成了实验所需要的抗原性肽段,高效液相色谱法(HPLC)结果显示其纯度为95.5%。以该合成肽为抗原建立的检测AsAb(IgG)的间接ELISA方法,与商品化试剂盒相比符合率为93.3%。结论:所合成的人SP17抗原肽具有较好的抗原活性,可作为间接ELISA法的包被抗原用于抗精子抗体的检测。

三种血小板抗体检测方法的方法学对比研究

目的 探讨血小板抗体不同方法学检测差异。方法 83份经临床评估血小板输血无效标本进行不同方法检测比较,包含:固相酶联免疫吸附检测、液相芯片检测、固相凝集捕获检测,评估不同检测方法的敏感度、重复性与一致性。结果 83份标本中3种方法一致性结果为71份(62份阳性,9份阴性),液相芯片检测与酶联免疫吸附检测一致性为95.2%(Kapp值:0.829,P<0.05);酶联免疫吸附检测与固相凝集捕获检测一致性为85.5%(Kapp值:0.512,P<0.05);液相芯片检测与与固相凝集捕获检测一致性为90.3%(Kappa值:0.636,P<0.05)。12份检测不一致标本中,3份仅有固相凝集捕获检测阳性,其他方法阴性,与6位随机献血者交叉配血结果呈现部份交叉配血结果不相合;5份为仅有固相凝集捕获检测阴性,皆为HLA抗体所致;其余4份的固相凝集捕获检测与液相芯片检测皆为阳性,固相酶联免疫吸附检测为阴性。结论 3种检测方法一致性为85.5%,不同方法有各自局限性。固相凝集捕获检测具备快速、中国注册与经济优势可作为初步筛选;液相芯片检测具备最佳诊断力但是用于高通量与HPA/HLA抗体分析;固相酶联免疫吸附检测具备方便操作的优势。联合多种检测方法使用可有效诊断血小板抗体检测。

精子肽的固相合成及其在免疫性不孕诊断中的应用研究

目的合成特异性精子肽,并对其抗原性进行初步评价,从而探讨检测抗精子抗体的ELISA试剂盒制备。方法应用固相多肽合成技术,以Fmoc基团保护的氨基酸为原料,合成特异性精子肽。以高效液相色谱(HPLC)技术鉴定纯化,并用ELISA检测其抗原性。结果成功合成了所需肽段,HPLC结果显示纯度达95%以上。该合成肽包被的ELISA试剂盒检测抗精子抗体的结果,与商品化试剂盒相比较符合率达90.6%。结论固相多肽合成技术可用于合成高纯度特异性的精子肽,且所合成肽段具有良好的抗原活性,包板建立的ELISA方法可以用于免疫性不孕中抗精子抗体的检测。

玉树牦牛O型、Asial型口蹄疫疫苗免疫抗体效价分析

[目的]为预防控制牦牛口蹄疫病提供参考,对玉树部分县牦牛口蹄疫疫苗免疫状况进行了抗体水平调查。[方法]实验采用O型、Asial型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA法对306头牦牛血清进行O型、Asial型口蹄疫二联疫苗抗体水平检测。[结果]表明:囊谦、称多、杂多、治多四县牦牛口蹄疫O型、Asial型疫苗抗体具有50.00%以上保护力的比例分别为:90%、86.33%。玉树地区口蹄疫免疫状况良好,但各县之间免疫情况存在较大差异,治多、杂多两县口蹄疫抗体水平较低。

不同方法检测猪O型口蹄疫疫苗抗体效价与攻毒保护相关性研究

为评价不同检测方法检测的口蹄疫疫苗抗体效价与免疫保护率的相关性,使用O型液相阻断ELISA、正向间接血凝试验、VP1结构蛋白抗体ELISA三种检测方法对免疫不同类型O型口蹄疫疫苗的60头猪进行血清抗体跟踪测定,免疫21 d后,分别用OZK/93和O/(XJ/10-11/MYA/98)毒株进行攻毒保护实验。数据统计和分析结果显示,O型液相阻断ELISA试验测定的抗体效价与攻毒保护率存在着极显著的正相关性(P<0.01),相关系数为0.75;正向间接血凝试验测定的抗体效价以及VP1结构蛋白抗体ELISA法测定的S/P值与攻毒保护率之间均不存在线性相关关系(P>0.05)。试验表明,O型液相阻断ELISA抗体检测方法可作为田间猪O型口蹄疫疫苗免疫效果的评价方法。

MN-151酶联免疫法检测双链DNA抗体

检测双链DNA抗体是诊断系统性红斑狼疮的特异方法。应用MN-151固相载体建立了检测双链DNA抗体的ELISA法。本法检测双链DNA抗体的敏感度达93％,高于传统ELISA法。

贺兰县奶牛O型口蹄疫免疫抗体水平监测与分析

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性的动物疫病,被国际兽医局(OIE)列为A类传染病之首.本试验采用液相阻断酶联免疫吸附试验(LPB-ELISA)方法对贺兰县周边地区的180份奶牛血清抽样样本进行了口蹄疫O型抗体的检测.监测结果显示免疫抗体合格率达80%,表明贺兰地区的奶牛O型口蹄疫免疫效果较好.

口蹄疫病毒O型中和抗体检测固相阻断ELISA方法的建立

[目的]为评价O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)灭活疫苗免疫后中和抗体(neutralizing antibodies,NA)水平,建立检测中和抗体的固相阻断ELISA(neutralizing antibodies solid-phase blocking ELISA,NA-SPBE)方法。[方法]本研究以本实验室前期制备的FMDV广谱反应性牛源单克隆抗体E32作为捕获抗体,以生物素标记的FMDV O型型内广谱中和牛源单克隆抗体C4作为检测抗体,经过条件优化建立了检测FMDV O型中和抗体的固相阻断ELISA方法,并对该方法进行了敏感性、特异性、重复性、交叉反应性与病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)相关性等试验。[结果]抗体E32最佳包被浓度为0.5μg/mL,O型FMDV灭活抗原最佳稀释浓度为0.25μg/mL,生物素标记抗体C4-Bio最佳工作浓度为0.06μg/mL,链霉亲和素-HRP的最佳稀释度为1:40000。以1.35 log10作为效价判定临界值时,敏感性和特异性分别为97.14%和98.84%。利用该方法分别检测FMDV A型、FMDV Asia1型、BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV抗体阳性血清时,均为阴性,未出现交叉反应。该方法批内和批间重复试验的变异系数均<10%,表明其重复性较好。利用该方法与VNT分别对160份血清样品进行检测,二者的相关系数r为0.8075,P<0.0001,相关性显著。[结论]该方法可以检测FMDV O型中和抗体,为FMDV O型灭活疫苗免疫效果评价提供有力技术支撑。