抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合。该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础。

南极鱼Ⅲ型抗冻基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

为了探讨多聚AFPⅢ的作用机制,从南极鱼Lycodichthys dearborni的多聚三型抗冻蛋白基因LD12 c DNA中克隆得到AFPⅢ的四聚体,命名为LD4,并构建真核表达质粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。将表达质粒转染到斑马鱼细胞系ZF4中,发现LD4可以在ZF4中大量表达并且能够减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。通过对不同处理温度(28、18、10℃)下的WT、EGFP和LD4细胞进行转录组测序分析,找出26个表达差异转录因子,其中I3MB13、ZNF687b等表达上调,JUN、Cremb等表达下调,并且通过荧光定量PCR的验证。通过KEGG pathway分析发现,这些差异性基因主要参与细胞凋亡、细胞周期、增殖等调节通路。采用Annexin V-PE/7-AAD双染色法对3种不同温度下的WT、EGFP和LD4细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,LD4在低温下与对照组相比凋亡率没有显著差异,说明LD4可能是通过其他通路而不是通过抑制细胞凋亡来抵御低温胁迫,这为LD4作用机制的进一步研究提供了理论基础。

南极eelpout(Lycodichthys dearborni)多聚体Ⅲ型抗冻蛋白基因的克隆及进化分析

冰冻海洋中生存的南极eelpout(Lycodichthysdearborni)体内能合成高浓度的Ⅲ型抗冻蛋白(AFPⅢ)。为了寻找新的AFPⅢ基因,构建了L.dearborni肝脏cDNA文库。通过斑点杂交筛选此文库,发现一个2.87kb 的cDNA克隆,LD12。序列分析采用DNAssist2.0和ClustalX1.8软件。结果显示,LD12分子由12个串联重复的片段构成,每一个片段编码一个61个氨基酸(aa)的Ⅲ型抗冻蛋白分子和一个9aa的连接子。这是第一次在合成AFPⅢ的极地鱼类中发现这样的多聚蛋白结构基因。有趣的是,组成、结构和起源都不相同的抗冻糖蛋白AF GP,其基因也呈现类似的多聚蛋白结构的现象。因此,这种独特的多聚基因结构可能是鱼类基因组在适应极端寒冷的环境中采取的一种普遍方式。

使用圆二色性光谱和红外光谱研究冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构

使用圆二色性光谱和红外光谱技术对冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构进行了研究。由于冬小麦麸皮抗冻蛋白在酰胺Ⅰ带和Ⅲ带位置中,各个特征峰相互叠加,因此采用Gausse峰型对圆头峰进行拟合、解析,判断其α-helix,β-sheet,β-turn和Random coil的相对含量;同时对圆二色性光谱获得的结构信息,采用按照Chen-Yang原理和最小二乘法编写的程序计算了冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构。最后,讨论了两种检测方法结果差异的原因,为冬小麦麸皮抗冻蛋白抗冻机理的研究奠定基础。

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。