CD55、CD59在健康者红细胞及中性粒细胞上表达的研究

目的探讨CD55和CD59在健康者的红细胞及中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞上的表达。方法采用流式细胞技术检测健康体检者外周血红细胞及中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞膜上CD55和CD59表达的百分率及平均荧光强度。结果 CD55在中性粒细胞及单核细胞上的表达率(99.50±1.987,98.63±1.629)及平均荧光强度(11.14±2.927,13.37±4.127)均高于在淋巴细胞和红细胞上的表达(P<0.01);CD59在红细胞、中性粒细胞及单核细胞上均高表达(大于98.21±1.857)且差异无统计学意义(P>0.05),在淋巴细胞上的表达及平均荧光强度均低于其他组(P<0.01),CD59在红细胞和中性粒细胞上表达的荧光强度(8.65±1.655,8.595±2.091)高于其他两组(P<0.01)。结论采用流式细胞术检测CD55、CD59表达时应选取中性粒细胞及成熟红细胞作为靶细胞。

CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase-3和survivin作用

目的检测CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase-3、survivin表达水平的影响,探讨CD59位点短肽封条促肿瘤细胞凋亡的可能机制。方法将CD59位点短肽封条作用于HeLa细胞,利用免疫组织化学方法检测短肽封条作用12 h和24 h后HeLa细胞caspase-3、survivin的表达水平。结果caspase-3表达随短肽封条剂量和作用时间的增加而增加;survivin表达随短肽封条的剂量和作用时间的增加而减少。结论CD59位点短肽封条能下调survivin的表达并活化caspase-3,从而可能导致HeLa细胞的凋亡。

体外循环手术对红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫的影响

目的探讨体外循环(extracorporeal circulation,ECC)手术对红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫功能的影响。方法选择ECC手术病例18例,于转机前、体温最低点、转机末和术后1 d、3 d、7 d晨采集患者静脉血,测定红细胞CD35、CD59,以及T淋巴细胞CD3、CD4和CD8。结果ECC前至ECC末,CD35+红细胞(CD35+-E)百分率、CD59几何平均荧光强度比值(CD59-GMFIR)和CD35-GMFIR均逐渐降低,前二者在术后1 d至7 d逐渐回升,而CD35-GMFIR未见明显恢复趋势。ECC末、术后1 d时CD35+-E百分率和CD35-GMFIR,以及体温最低点、ECC末和术后1 d时CD59-GMFIR均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)。至术后7 d时,CD35+-E百分率、CD35-GMFIR和CD59-GMFIR仍未恢复至ECC前水平。从ECC前至术后7 d,CD3+T淋巴细胞(CD3+-T)百分率、CD3+CD4+-T百分率和CD4+-T/CD8+-T比值均呈现先降低后升高的趋势,体温最低点、ECC末、术后1 d和术后3 d的CD3+-T百分率、CD3+CD4+-T百分率均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05),至术后7 d恢复至接近于ECC前水平,而CD4+-T/CD8+-T比值则恢复至超过ECC前水平。结论ECC手术使红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫功能下降,后者于术后7 d恢复,前者恢复期长于后者。

CD59蛋白表达在外周神经损伤型神经病理性疼痛中的意义

目的观察CD59蛋白在大鼠3种外周神经损伤模型脊髓背角的表达情况,以探讨其在神经病理性疼痛(neu-ropathic pain,NPP)发病机制中的作用。方法选择80只健康雄性SD大鼠分为假手术组、慢性坐骨神经缩窄性损伤模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)组、坐骨神经分支选择性损伤模型(spared nerve injury,SNI)组和选择性脊神经结扎模型(spinal nerve ligation,SNL)组等4组,按分组制作模型,分别于术前、术后1、3、7 d用热刺激和机械刺激法测定大鼠的痛阈值变化,评估其可靠性后,于术后7 d处死大鼠,取腰4～腰6段脊髓背角,用Western-blot和流式细胞两种技术测定CD59蛋白含量。结果 CCI组、SNI组、SNL组大鼠于术后1、3、7 d痛阈值降低,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05),模型制作成功。Western-blot检测显示,3组模型大鼠脊髓背角CD59蛋白表达均不同程度降低,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞检测显示假手术组大鼠脊髓背角细胞CD59阳性表达率为93.92%,而CCI组、SNI组和SNL组CD59阳性表达率分别为86.78%、85.68%和85.70%,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NPP大鼠脊髓背角细胞CD59蛋白表达下降,可能是此处发生补体级联反应的重要原因,CD59蛋白在NPP的形成中发挥一定作用。

CD55、CD59在特发性血小板减少性紫癜发病中的研究

目的探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者外周血中血小板表面CD55、CD59抗原表达在其发病中的作用。方法应用流式细胞仪检测30例ITP患者及30例健康对照者外周血血小板表面CD55、CD59抗原表达。结果 ITP患者血小板表面CD55、CD59抗原表达率均明显低于健康对照组(P<0.01)。结论血小板膜上CD55、CD59的缺陷在ITP发病中起着重要的作用。

COULTER流式细胞仪采用自配试剂在CD55、CD59水平检测中的应用探讨

目的探讨美国COULTER流式细胞仪试剂国产化问题。方法将自配鞘液及清洗液的理化性质、精密度、准确度、稳定性与原装试剂进行对比分析。结果自配试剂与原装试剂理化性质一致,采用自配试剂测定15份患者标本CD55、CD59水平并与原装试剂对比,差异无统计学意义(P>0.05),两者呈高度正相关(r>0.95)。自配试剂稳定性好,放置1年后,用原装试剂分别测定15份标本,结果差异无统计学意义(P>0.05),两者呈高度正相关(r>0.95)。结论自配美国COULTER流式细胞仪试剂完全可以代替原装进口试剂进行CD55、CD59的检测。

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法用DNA重组技术,将3条60bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径。

CD59基因的突变并真核表达载体的构建

目的构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体。方法选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切获得目的基因,重组入真核表达载体pIRES。结果通过PCR定点诱变成功获得两种目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES-m1CD59、pIRES-m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp。结论重叠延伸PCR法诱变经济可靠,重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础。

CD59与CD3在T细胞活化信号转导中的协同作用

目的前期构建的真核表达载体pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD3分子在T细胞活化信号转导中的相互作用,进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi;脂质体法将两种载体分别转染Jur-kat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系;RT-PCR技术检测转染后CD59和CD3ζ在mRNA水平的表达抑制效果;采用噻唑蓝比色法检测转染前后各组Jurkat细胞的增殖效应,Western Blot技术检测各组细胞ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平,激光共聚焦扫描显微镜检测各组细胞内Ca2+变化,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)的变化。结果重组载体转染后RT-PCR结果表明,转染pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi质粒的细胞组CD3ζ分子和CD59分子的表达分别受到抑制。转染干扰质粒的细胞组细胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平、Ca2+浓度及IL-2水平均明显低于未转染组和空质粒组,差异有显著性(F=96.13～328.60,q=6.27～32.664,P<0.01)。结论 CD59和CD3在T细胞活化信号转导中具有协同作用。

CD55,CD59抗原表达在PNH合并全血细胞减少症诊断中的应用

目的探讨红细胞和粒细胞膜CD55与CD59抗原表达在阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)合并全血细胞减少症(PCP)诊断中的应用。方法采用流式细胞术结合直接免疫荧光法,检测PCP患者病因可疑为PNH的的外周血红细胞和粒细胞膜CD55与CD59抗原的表达。结果 125例中,PNH32例,非PNH 93例(包括再生障碍性贫血80例,病因不明PCP 13例)。外周血红细胞膜CD55和CD59抗原表达缺失诊断PNH合并PCP敏感度和特异度分别为93.75%和82.80%,粒细胞膜CD55和CD59抗原表达缺失诊断的敏感度和特异度分别为100%和81.72%。随访中,非PNH病例中有13例转化为PNH;这些病例的红细胞膜CD55和CD59抗原表达缺失率分别为84.62%和92.31%,粒细胞膜CD55和CD59抗原表达缺失率分别为92.31%和100%。结论利用流式细胞术同时检测患者红细胞和粒细胞膜CD55与CD59抗原对PNH合并PCP的的诊断及鉴别诊断具有重要的价值。

CD59转染细胞Caspase-3和Bcl-2基因的表达

目的探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系。方法应用免疫组化方法,分别测定空pIRES、野生型pIRES-WTCD59和突变型pIRES-MCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2的表达。结果转染野生型pIRES-WTCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.462、3.958,P<0.05);转染突变型pIRES-MCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.212、3.956,P<0.05);转染野生型pIRES-WTCD59组与突变型pIRES-MCD59组比较,Caspase-3、Bcl-2表达差异无显著性(Z=1.948、0.544;P>0.05)。结论CD59分子具有抑制凋亡的作用,而其保守位点W40与凋亡信号的传导无关。

CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响

目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体-pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RT-PCR及Westernblot方法检测细胞表面CD59 mRNA及蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与WT-A2780比较均明显下降(t=9.217、.20,P<0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P<0.05)。结论CD59配体肽基因可影响人卵巢癌细胞A2780表面CD59的表达,有望用于肿瘤治疗。

CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断中的意义

目的 探讨CD5 9检测对阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (paroxysmalnocturnalhemoglobinuria ,PNH)及再生障碍性贫血 (AA) PNH综合征的临床诊断意义。方法 用FITC标记的CD5 9单抗 ,以流式细胞仪检测 13例PNH、37例AA和 2 0例正常人外周血红细胞和粒细胞膜表面CD5 9的表达情况。结果 正常人红细胞和粒细胞CD5 9表达阳性率均 >98% ;13例PNH患者红细胞及粒细胞CD5 9表达阳性率均 <90 % ;37例再障患者中 2 4例表达正常 ,13例红细胞或粒细胞CD5 9表达阳性率均有不同程度的减低。结论 CD5 9检测是诊断PNH较直接而又特异、敏感的方法 ,特别是对表现不典型的PNH及AA

流式细胞仪检测CD55与CD59诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症

目的 :探讨 CD55、CD59对阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH)的临床诊断意义。方法 :应用流式细胞仪 (FCM)检测人体外周血红细胞、粒细胞、淋巴细胞的表面抗原 CD55、CD59的表达水平。结果 :PNH患者 CD55、CD59表面抗原在红细胞、粒细胞、淋巴细胞上均有不同程度的缺乏 ,尤以红细胞、粒细胞较明显。再生障碍性贫血患者的红细胞、粒细胞、淋巴细胞 CD55、CD59表面抗原标记阳性率与正常对照组比较差异无显著性 (P>0 .0 5)。结论 :流式细胞仪检测 PNH患者外周血红细胞、粒细胞、淋巴细胞 CD55、CD59表面抗原具有重要的临床诊断意义。

CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响

目的观察CD59结合短肽（sp22）对补体介导高表达人CD59分子的PC-3细胞溶解的影响。方法利用脂质体法将携带人野生型CD59基因的pIRES质粒（wCD59-pIRES）转染PC-3细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,荧光免疫组化技术检测细胞表面CD59分子的表达,补体溶解试验观察sp22和抗CD59单克隆抗体对补体介导的高表达CD59分子的PC-3细胞溶解的影响。结果高表达CD59分子的PC-3细胞株构建成功;与对照组比较,sp22组转染细胞的溶解率显著升高（F=719.552,q=12.181-79.942,P〈0.05）;相同浓度条件下,sp22组转染细胞的溶解率明显高于抗CD59单克隆抗体组（q=7.805-12.280,P〈0.05）。结论sp22可封闭PC-3细胞表面高表达CD59分子的补体结合位点,显著增强抗PC-3细胞抗体所诱发的补体介导的抗瘤作用。

糖尿病病人突变CD59蛋白在真核细胞中的表达

目的构建两种含有人CD59蛋白突变体的真核表达载体,获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞真核表达系统,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础。方法将两种含有不同突变体的人CD59全长cDNA序列重组pALTER质粒,应用阳离子脂质体导入法与pcDNA共转染CHO细胞,用G418筛选阳性克隆,应用细胞免疫组化及流式细胞仪检测CD59在CHO细胞表面的表达。结果含有人CD59两种突变体的重组pLATER质粒经酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长496 bp的电泳条带,与所插入片段完全相符。运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒共转染CHO细胞成功,筛选出的阳性克隆经细胞免疫组化检测,证明突变的CD59可在CHO细胞表面表达,流式细胞仪测定表达率分别为68.6%、71.7%。结论成功建立了两种高效表达人CD59突变体的真核表达系统,能够进一步研究人CD59的突变体糖基化及抗补体活性,为阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定了基础。

肝硬化患者红细胞CD59表达与凝血酶原活动度变化的关系

目的 研究肝硬化患者红细胞CD5 9表达数量的变化与凝血酶原活动度 (PTA)的关系。方法 采用细胞酶联法对 10 9例肝硬化患者的红细胞CD5 9进行测定 ,同时采用AU6 0 0全自动生化仪检测其胆碱酯酶、胆红素 ,采用ACL2 0 0检测PTA。结果 肝硬化患者红细胞CD5 9表达数量显著低于正常对照 (P <0 .0 5 ) ;CD5 9≥ 2 .2组与CD5 9<2 .2组比较 ,PTA有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,病情程度积分比较也有极显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 红细胞CD5 9数量变化与肝硬化患者的病情严重程度关系密切。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血细胞表面CD55和CD59的检测及临床意义

目的探讨红细胞和粒细胞膜CD55与CD59抗原表达在阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)诊断中的应用。方法采用流式细胞术结合直接免疫荧光法检测25例PNH、20例再生障碍性贫血(AA)、20例健康对照者外周血红细胞和粒细胞膜CD55和CD59抗原的表达,并同时做酸化血清溶血试验(Ham试验)、蔗糖溶血试验和尿含铁血黄素试验(尿Rous试验)。结果与AA组和健康对照组相比,PNH患者外周血红细胞、粒细胞膜CD55、CD59表达缺失率均明显增高(P<0.05);而AA组和健康对照组缺失率均小于5%,且两者之间差异没有统计学意义(P>0.05)。25例PNH患者中,9例Ham试验阴性,6例蔗糖溶血试验阴性,7例尿Rous试验阴性,这些患者的红细胞、粒细胞的CD55、CD59表达缺失率均大于5%。结论利用流式细胞术同时检测患者红细胞和粒细胞膜CD55与CD59抗原对PNH的诊断与鉴别诊断具有重要价值。

转录因子Sp1在肿瘤细胞CD59表达调控中的作用

目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1对CD59表达的影响。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418筛选建立稳定表达转染基因的细胞株,RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Sp1和CD59基因的表达,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用。结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体,转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的PC-3细胞CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础。

CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

目的构建CD59突变的重组体，研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase-3表达的变化。方法采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTER—MAX质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株，用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase-3表达的变化。结果酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒。转染突变CD59后Hela细胞内caspase-3表达明显减少，与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义（t=2．846，P〈0．01）。结论caspase-3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。