结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力

目的 研究结核分支杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力。方法 分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)和MPT64重组质粒 (D)免疫小鼠 ,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体 ,免疫 8周后以MTB腹腔内攻击小鼠 ,攻击 4或 9周后 ,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验。结果 D组1 0只小鼠中只有 4只血清中检测出抗MPT64抗体。MTB攻击 4周后 ,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它 3组 ,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组 ,A组脾菌落数较其它 3组明显增多 ,其余脏器菌落数各组无明显区别 ,A、B组可见肺部严重病变 ,C组未见明显病变 ,D组存在个体差异。MTB攻击 9周后 ,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低 ,D组显著增高 ,各组肺、肝和脾重量无显著差别 ,C组肝菌落数明显低于其它 3组 ,其余脏器各组间无显著差别 ,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变。所有鼠肝、脾均未见明显病变。结论 MTBMPT64DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答 ,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力 。

结核分枝杆菌Ag85A/MPT-64融合基因DNA疫苗的构建及免疫研究中ELISPOT技术的应用

目的构建结核分枝杆菌蛋白Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗,并利用ELISPOT技术检测其免疫原性。方法利用PCR和基因克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85A/MPT-64编码基因,构建真核表达载体,用酶切和双向DNA测序进行鉴定。鉴定正确的阳性克隆重组质粒,肌注免疫小鼠,3周后用ELISPOT法检测抗体滴度。结果 构建到真核载体中的结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A/MPT-64融合基因经序列测定证实无突变。ELISPOT法检测几何平均滴度为1∶1 000。结论以Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达以及ELISPOT技术的应用,为进一步研究其在结核病与肿瘤防治方面的作用奠定了基础。

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗的纯化及免疫效果

目的：研究结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠的效果。方法：通过 Qiagen 质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA；将 25 只 BALB/c 小鼠随机分为四组，生理盐水组、载体质粒组和重组质粒组于第 0 周、第 3 周、第 6 周经肌肉注射免疫小鼠各 1 次，卡介苗组只在 0 周时于皮内注射卡介苗 1 次；通过 ELISA 方法检测小鼠血清中抗 MPT64 抗体。结果：纯化后的 JW4303 和 JW4303-MPT64 质粒 DNA 经电泳证实无 RNA 污染，OD260/OD280大于 1.8，每 2 000 ml 培养菌可获得 2 mg 左右的质粒 DNA。以三个对照组 15 只小鼠的血清抗 MPT64 抗体 OD值x＋2s为正常界限值，免疫 4 周时重组质粒组 10 只小鼠中只有 4 只血清中抗 MPT64 抗体阳性；免疫 7 周时有 5 只小鼠抗体阳性，抗体水平较前略微增高。结论：结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答，免疫效果存在明显的个体差异。

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护。方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM)。分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度。结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P<0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P<0.05)。与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P<0.01),IL-4分泌水平下降(P<0.01);pUM组的CTL活性高于pM组。提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答。结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效。

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。方法利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Hetrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率;LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性。结果成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P<0.05);特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P<0.05);然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)%]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)%(t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)%(t=0.234,P>0.05)、(25.28±2.51)%(t=0.726,P>0.05)]。结论成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。

泛素-结核抗原融合基因DNA疫苗诱导的小鼠细胞免疫应答

目的 构建结核杆菌Ag85A抗原DNA疫苗（pA）和泛素基因与Ag85A抗原基因融合的DNA疫苗（pUA）,观察疫苗在小鼠中的免疫应答.方法 将构建的DNA疫苗pA和pUA分别肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体（IgG、IgG1、IgG2a）、细胞因子（IFN-γ、IL-4）和细胞毒性T淋巴细胞反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答的强度.结果 pA组小鼠血清IgG水平高于pUA组（P＜0.01）,但IgG2a/IgG1比值（4.16±0.20）低于pUA组（7.88±0.30）（P＜0.01）.与pA组比较,pUA组小鼠IFN-γ分泌水平增高（P＜0.01）,IL-4分泌水平下降（P＜0.01）;pUA组的CTL活性高于pA组.结论 融合的DNA疫苗pUA诱生的抗原特异的体液免疫应答不及单基因DNA疫苗pA,但其能诱导更强的细胞免疫应答.提示泛素-Ag85A融合基因DNA疫苗对于防治结核病比单基因DNA疫苗更为有效.