抗菌肽Japonicin Ⅱ基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

采用重叠区基因扩增法(SOE)人工设计和合成抗菌肽JaponicinⅡ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,构建出的重组质粒pPICZαA-Jap,经电击法转化至GS115宿主菌,Zeocin筛选的阳性克隆用甲醇诱导表达,用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性;利用琼脂孔穴扩散法证明了表达产物具有抗菌活性。

抗菌肽Japonicin II基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin II基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin II基因的重组质粒pPICZαA-Jap,结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinII基因真核表达载体pPICZαA-Jap。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物对金黄色葡萄球菌细胞膜作用机制的研究

为研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B对金黄色葡萄球菌细胞膜的作用机制,用流式细胞仪分析BF2-A/B对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响,以及穿膜效率,用透射电镜观察细胞膜的完整性,激光共聚焦显微镜观察抗菌肽在胞质内的积累。结果显示,BF2-A/B都不显著引起PI流入细胞质内,但BF2-B处理的细胞PI着染阳性比例高于BF2-A。BF2-A处理20min后的细胞膜依然完整,而BF2-B能使胞质内容物轻微泄漏。抗菌肽BF2-A/B都能显著穿透细胞膜,并且BF2-B的穿膜效率高于BF2-A。同时荧光共聚焦显微镜也证实抗菌肽在细胞质内的累积。研究结果说明BF2-A/B并不破坏金黄色葡萄球菌细胞膜,而是进入细胞内实施抗菌活性。BF2-B在穿透细胞膜的过程中对膜的扰动较大,导致了PI的少量流入以及细胞内容物的泄露,同时穿膜效率提高,抗菌活性更强。

棘腹蛙Japonicin-pb抗菌肽的分离及表达谱分析

本试验旨在克隆棘腹蛙来源Japonicin-pb,了解该抗菌肽在不同生长温度及组织下的表达规律,为Japonicin-pb的开发提供线索。基于本实验室构建的棘腹蛙皮肤转录组数据库,利用反转录PCR从棘腹蛙皮肤组织中克隆Japonicin-pb前体序列,通过结构域比对的方法分析其结构。利用Real-time PCR检测3种Japonicin-pb在不同生长温度(15、18、21、24、27和30℃)及组织(血液、肌肉、肝脏和皮肤)的表达图谱。结果表明,本试验克隆到3种Japonicin-pb前体序列,结构域比对表明,三者拥有相同的N端信号肽和中间间隔区,长度分别为19、20和12个氨基酸残基的肽序列,命名为Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb。Japonicin-1apb主要在皮肤组织中表达,且表达量随着生长温度的升高而逐渐增加;Japonicin-1bpb在不同组织或生长温度下的表达量差异均不明显;Japonicin-3pb主要在肝脏中表达,且生长温度对其影响不大。这些结果为棘腹蛙源3种Japonicin-pb后续功能研究以及开发应用提供了重要的序列及表达谱信息。

抗菌肽buforinⅡ的研究进展

抗菌肽buforinII是由亚洲蟾蜍bufo bufo gargarizans胃组织中分离得到一种烈性抗菌肽,具有很强的抗菌活性。它的结构和多数α螺旋抗菌肽相似,但作用机制却有较大的区别。BuforinⅡ利用其特有的结构在不造成膜穿孔的情况下迅速通过细胞膜,与胞内的生物大分子核酸结合,诱发细胞死亡。本文就buforinⅡ的结构,作用机制,研究现状及其应用前景进行阐述。

抗菌肽magaininⅡ对E.coli杀伤作用的AFM观察

利用原子力显微镜(AFM)观察了不同浓度magaininⅡ对E.coli的作用效果。分别用低于MIC和高于MIC浓度的magaininⅡ作用E.coliD31,结果发现当magaininⅡ浓度低于最低抑制浓度MIC时,细菌外膜的粘弹性增大,膜表面产生数量、大小不等的囊泡结构。当magaininⅡ高于MIC时,细胞很快破损,胞浆内容物外泄,菌体破裂导致死亡。推测magaininⅡ分子可能以“地毯”模式迅速集结于细胞膜上,环绕菌体切断细胞膜。这些结果都说明微生物的细胞膜结构是抗菌肽攻击的首要靶点。

一种不易诱发耐药性的新型抗生素teixobactin的研究进展

细菌耐药问题已经成为21世纪世界上最大的健康问题之一。发现新抗生素的速度越来越慢以及新耐药细菌的产生加速了新抗生素的需求。来源于难培养土壤微生物的缩肽类抗生素teixobactin具有独特新颖的抗菌机制,即和细菌细胞壁上肽聚糖前体脂质Ⅱ及壁磷壁酸前体脂质Ⅲ的保守序列结合,以致细菌细胞壁不能合成,可以杀死多种耐药性致病菌,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等。这种特殊的作用方式使病原体对其很难产生耐药性,因此,teixobactin被认为是"明星抗生素"。自teixobactin发现以来,它的生物活性、作用机制、构效关系等逐步被揭示,其化学全合成也得以实现,但是生物合成的研究相对滞后。本文总结了近几年来有关teixobactin的研究进展,讨论了其不易诱发耐药性的机制,并展望了其在生物合成方面的研究。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物抑制大肠杆菌大分子合成的研究

【目的】研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B作用大肠杆菌后对胞内生物大分子合成的影响。【方法】紫外分光光度法检测抗菌肽对细胞DNA、RNA合成能力的影响,考马斯亮蓝法检测抗菌肽对细胞总蛋白合成能力的影响,分别用邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法和对硝基苯磷酸二钠法检测抗菌肽对β-半乳糖苷酶及碱性磷酸酶表达活性的影响。【结果】BF2-A/B不优先抑制DNA合成,而是优先抑制RNA和蛋白的合成。在相同浓度下,BF2-B抑制RNA合成的能力比BF2-A强,BF2-A抑制蛋白合成的能力比BF2-B强。胞内酶β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的表达活性都在下降。【结论】BF2-A/B结合胞内核酸后,没有首先影响DNA的复制功能,而是优先抑制基因转录功能,主要在转译水平上抑制蛋白的合成。