通用TaqMan探针技术在apoE基因3937T/C单核苷酸多态性检测中的应用

目的 建立一种基于通用TaqMan探针技术的快速、准确且经济的实时荧光PCR方法 ,用于检测apoE基因第四外显子上的一个单核苷酸多态性 (SNP)位点 (3937T/C)。方法 应用PCR RFLP分型方法建立apoE 3937T/C多态性分析的参考样本 ,同时对部分样本进行PCR产物直接测序以验证PCR RFLP分型结果。选择一对能够有效区分 3937T/C多态性的等位基因特异的上游引物 ,配对进行通用TaqMan探针实时PCR扩增 ,然后通过比较两个平行反应达到阈值时所经历的循环数 (Ct)的大小 ,对apoE 3937T/C多态性进行区分。结果 建立的基于通用TaqMan探针技术的实时荧光PCR方法 ,用于apoE基因第四外显子上 3937T/CSNP分析 ,检测结果与PCR RFLP方法、DNA测序法结果完全一致。结论 在进行PCR扩增条件优化的前提下 ,应用通用TaqMan探针对PCR进行全程监测是可行而且是非常经济的 ;基于通用TaqMan探针技术的等位基因特异的实时荧光PCR方法敏感、简单、快速 ,可实现对apoE基因 3937T/C单核苷酸多态性的快速检测 。

人apoE_7基因在NIH/3T3细胞中瞬时及稳定表达

目的为了探索人apoE_7基因受控于异源启动子MT-I时,能否在鼠类细胞中表达。方法自10.3 kb人apoE_7基因组DNA获得不带自身启动子的人apoE_7基因组DNA片段(60 kb),与小鼠金属硫蛋白启动子(MT-I)重组,构建pME_7真核表达质粒,用Lipofectamine转染NIH/3T3细胞。结果瞬时表达结果表明,重组pME_7质粒能够在NIH/3T3细胞中表达。稳定表达的结果则表明,人apoE_7基因的表达水平与其整合到宿主细胞基因组的拷贝数密切相关。ELISA测定结果显示,人apoE_7基因在NIH/3T3细胞中可以进行正确的转录剪切和翻译加工,合成有生物活性的人apoE_7蛋白;研究结果还表明:重金属可以诱导增强人apoE_7基因的高效表达,诱导后表达水平提高45%～60%。结论人apoE_7基因的表达不仅局限于人类的组织细胞,也可以在鼠类组织细胞中表达;而且MT-I启动子能够诱导表达人apoE_7基因,为人apoE_7转基因小鼠模型的建立奠定了基础。

转人t-PA指形区缺失基因的山羊体细胞核移植及其继代核移植

为了探索转基因体细胞核经连续核移植后的发育潜力，以转人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞为核供体，MII期的卵母细胞质为核受体，利用胞质内注射法构建原代核移胚胎（G0），并进行了原代核移植胚胎的继代核移植研究。比较原代和继代核移植胚胎在体外发育能力上的差异；在G1、G2代核移植试验过程中，比较了供体胚胎细胞的发育阶段对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明，原代核移植胚胎的卵裂率（76．45％±1．17％）与继代核移植胚胎的卵裂率（72．18％±1．97％，76．05％±2．38％，75．99％±2．84％）无显著性差异（P〉0．05）。但原代核移植胚胎的桑葚胚率（47．20％±2．93％）、囊胚率（11．00％±1．42％）显著高于G．、G2、G，代核核移植胚胎的桑葚胚率（34．99％±2．66％，28．23％±2．00％，23．34％±1．99％）、囊胚率（3．87％±0．67％，2．08％±1．66％，0）；在G1、G2中，当用16-细胞期核移植胚胎作为核供体时的桑葚胚率（29．57％±1．53％，24．43％±1．87％）、囊胚率（1．96％±1．31％，2．01％±1．34％）低于用32～64-细胞时期的核移植胚胎的桑葚胚率（34．32％±1．31％，29．76％±1．66％）、囊胚率（3．86％±1．03％，3．48％±0．34％），但无显著性差异（P〉0．05）。由此得出结论：转基因体细胞核移植胚胎不宜进行多代克隆；胞质内注射法构建核移植胚胎，用32～64-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率高于用16-细胞期的胚胎作为核供体构建的核移植胚胎的体外发育率。

生物技术减毒沙门氏菌介导apo-t-PA-GFP融合基因在鸡体内表达和在卵黄中沉积的研究

目的探讨以减毒沙门氏菌为载体携带目的基因在家禽体内表达,并实现表达产物在卵黄中定向沉积的可行性。方法将人t-PA基因与鸡VLDLy组装前体apo基因融合,构建pApo-tPA-GFP表达质粒,电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌△crpSL1344中,阳性重组菌静脉注射高产蛋鸡,收集不同时期鸡蛋,涂片荧光镜检和ELISA检测表达产物在卵黄中沉积情况和表达水平,平板溶圈法检测卵黄中表达产物的活性。结果注射表达质粒第8天开始卵黄中有荧光颗粒出现,第21天表达量最高,为10.4μg.mL-1,活性相当于50.2μg.mL-1标准品t-PA。结论研究表明,减毒沙门氏菌能够介导apo-t-PA-GFP融合基因在鸡体内表达,且apo载脂蛋白能够引导t-PA透过卵黄膜实现在卵黄中沉积,这一途径简捷、方便,为外源基因在动物体内的表达研究提供了理论和技术基础。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达

目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NI H3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NI H3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度。挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况。结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;用PCR能够从逆转录病毒感染的NI H3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NI H3T3细胞中表达目的蛋白;经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段。结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白。

重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建

目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度。结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH3T3细胞中表达目的蛋白。结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。

Apo-tPA融合蛋白在鸡胚肝细胞中的分泌表达及其活性检测

为了探讨apo—B100介导的t—PA融合蛋白在鸡胚肝细胞中分泌表达的可行性和生物学活性，将编码人组织型纤溶酶原激活剂功能区的基因片段△t—PA与鸡VLDLy组装前体apo—B100进行融合，定向克隆到pCDNA3表达载体CMV启动子下游，构建pCDNA3-apo—△tPA表达载体。将pCDNA3-apo-△tPA用脂质体包裹后转染体外培养的鸡胚肝细胞，ELISA检测融合蛋白表达水平，发色底物法检测表达产物的生物学活性。结果显示，融合基因在鸡胚肝细胞中能够表达并分泌到细胞外，48h表达水平最高达575．3ng／10^5（cells·24h），表达产物活性为135．8IU／10^6（cells·24h）。apo—B100介导的t—PA在鸡胚肝细胞中成功表达，为外源基因在鸡体内表达并实现在卵黄中沉积奠定了坚实的基础。

人组织型纤溶酶原激活剂c-DNA乳腺定位表达载体的构建及其在兔乳腺中的表达

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种用于治疗血栓性心血管疾病的特效药物,它能激活血纤维蛋白酶原,后者使血块溶解,所以这种药物的开发为社会普遍重视。t-PA在人体血液中的含量极低,很难从天然材料中提取。如果应用转基因技术,将人t-PA基因转入动物体内,使其在乳腺中高效表达,从乳汁中提取大量的t-PA,将具有可观的经济效益和社会效益。 转基因动物建立的前提条件是构建乳腺定位高效表达载体。为此,我们先将本所保存的t-