3种不同survivin基因启动子驱动Apoptin表达的重组慢病毒构建及体外抑瘤效果比较

目的构建3种不同长度的survivin基因启动子融合6×his标签Apoptin cDNA的重组慢病毒载体,经鉴定后行慢病毒包装并感染人结直肠癌细胞(SW480),体外实验观察并比较抑瘤效果。方法克隆3种不同长度的人survivin基因启动子(160、270、987 bp)和Apoptin-6×his cDNA,将其分别连接到pMD18-T载体并在该载体上完成survivin基因启动子和Apoptin基因组装。将组装好的表达盒构建入polyA改造后的慢病毒载体FG12中,利用三质粒包装系统包装成慢病毒。为观察重组慢病毒的抑瘤效果,以最适MOI值感染SW480肿瘤细胞后第5天及第30天,利用AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,Western blot检测Apoptin-6×his表达。结果成功构建3种重组慢病毒载体,经包装浓缩后获得高滴度病毒,可以有效地感染目的细胞(感染效率大于80%)。体外结果提示病毒感染的SW480可以正确表达Apoptin-6×his蛋白,并能在感染后第30天出现明显的凋亡/坏死。其中,含有270 bp启动子的慢病毒抑瘤作用更为明显。结论采用270 bp survivin启动子,apoptin基因构建的重组慢病毒在靶细胞中显示出较好的抑瘤效果。