ACLSV山东苹果分离物基因重组及CP序列多样性分析

【目的】明确苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)山东苹果分离物全基因组的分子特征、潜在重组事件及CP基因的多样性。【方法】采用RT-PCR分段扩增、克隆、拼接获得ACLSV全基因组序列,对其进行分子特征描述,并与已报道的16条全长基因组或近全长基因组序列进行比较和系统发育分析,同时扩增其CP进行多样性分析。【结果】扩增得到ACLSV山东苹果分离物QD-13全基因组序列(Gen Bank登录号KJ522693),QD-13全长7 557 nt,包含3个ORF。构建进化树分析表明,QD-13与日本苹果分离物B6聚为一簇,二者相似性最高,为85.9%。17条ACLSV分离物基因组分段比较表明,5′端和3′端差异较大;ORF3保守性相对较高,除分离物Ta Tao 5和MS外,其推导的氨基酸序列相似性均在91.2%以上。ORF1编码区527—665 aa区域保守性差,所比较的17条序列在该区域的相似性为15.4%—59.7%。基因组重组分析以P≤0.05为标准,3种以上算法同时检测到则为有意义重组事件,结果显示,QD-13存在3个重组事件,它们分别发生在6 507—6 247、6 397-6 497和3 851—4 760 nt。扩增QD-15、QD-20和YT-24分离物ACLSV的CP,共获得22条序列,可分为3种类型。对CP氨基酸序列进行比对分析表明,3种类型为不同氨基酸保守位点的组合,分别是Met60-Ser73-Ser79-Asp82-Asn97-Gly98、Leu59-Met83-Ile193和Ala40-Leu60-Ala72-Phe75-Ile86-Arg88-Ser130-Gly137-Met184。【结论】报道了中国ACLSV苹果分离物的完整基因组序列;明确了其基因组分子特点并发现了3个主要的潜在重组事件;ACLSV山东苹果分离物CP存在3种序列类型,具有丰富的多样性。

5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。

通辽市塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒的检测及变异分析

【目的】明确通辽地区塞外红苹果(Maluspumila‘Saiwaihong’)中苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV)3种苹果潜隐病毒的普遍率和遗传多样性。【方法】从通辽市开鲁县8个乡镇随机采集了96份塞外红苹果枝条,采用RT-PCR法对样品进行3种苹果潜隐病毒检测。对检测为阳性的样品进行病毒基因克隆、测序,并进行序列一致性分析和系统发育分析。【结果】检测结果表明,被检测的塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒均有不同程度的发生,并且存在2种或3种病毒的复合侵染。基于CP基因对病毒一致性和变异情况进行分析,结果表明,来源于塞外红苹果的29个ACLSV分离物的核苷酸序列一致性为78.1%~99.9%,与其他15个已知的ACLSV分离物的一致性为69.1%~93.6%;来源于塞外红苹果的12个ASPV分离物的核苷酸序列一致性为83.6%~99.7%,与其他15个已知的ASPV分离物的一致性为75.4%~91.5%;来源于塞外红苹果的21个ASGV分离物的核苷酸序列一致性为96.4%~100.0%,与其他已知的40个ASGV分离物的一致性为89.9%~98.9%。系统发育分析结果表明,44个ACLSV分离物聚集在7个主支,其中29个塞外红苹果的ACLSV分离物分别位于JB组、Balatonl组、B6组和一个独立分支;27个ASPV分离物聚集为6支,其中12个塞外红苹果的ASPV分离物分别位于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ组;61个ASGV分离物聚集为8个支,其中塞外红苹果的21个ASGV分离物聚集在一起,形成独立分支。【结论】ACLSV、ASGV、ASPV均能侵染塞外红苹果,并且发生率较高。与其他来源的病毒相比,塞外红苹果的3种病毒分离物,各种内各分离物彼此之间的序列一致性较好并且进化关系较近。研究结果为塞外红苹果产业绿色、健康、持续发展提供基本理论依据。

ACLSV外壳蛋白与梨两种E3泛素连接酶互作及亚细胞定位

为深入了解苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)与寄主植物的互作特性,构建了表达该病毒外壳蛋白(coat protein,CP)的诱饵载体pGBKT7-CP,采用酵母双杂交技术,从‘红香酥’梨cDNA文库中筛选出与ACLSV CP潜在互作的33种寄主因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证了CP与来自梨的两种RING型E3泛素连接酶(命名为MIEL和BOI)互作。亚细胞定位分析表明,CP与BOI具有相似的胞间连丝和细胞核分布特点,MIEL主要分布在内质网和细胞核。双分子荧光互补试验结果显示,CP与BOI互作不改变二者的亚细胞分布,而CP与MIEL互作信号分布与MIEL亚细胞定位相似。构建了这3种蛋白的截短突变体,发现含zf-CHY结构域(1~99aa)的MIEL截短突变体可以与CP互作,而仅全长BOI可以与CP互作,CP截短突变体不能与这两种寄主蛋白互作。

苹果褪绿叶斑病毒和茎沟病毒的鉴定提纯和酶联法检测

苹果褪绿叶斑病毒(CLSV)和茎沟病毒(SGV)是感染苹果和其它果树的两种重要潜隐病毒。根据生物学特性和血清学反应,确定 W-55分离物属于 CLSV,W-29分离物属于 SGV。采用皂土澄清,PEG 6000沉淀及超离心等步骤,得到部分提纯的病毒。经电镜观察,W-55和W-29病毒颗粒长度分别为800 nm 和650nm。用 CLSV W-55分离物制备的兔抗血清效价为1/3200,用 SGV PV-71(ATCC)分离物制备小鼠腹水抗体效价为1/800,均用间接 ELISA 法测定。对感染 CLSV 和 SGV 的昆诺藜、苹果叶和花瓣检测结果表明,P/N 值具有显著性。本工作为苹果无毒苗木的生产提供了快速、灵敏的病毒检测手段。

来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。

梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位RT-PCR检测

为了建立梨树苹果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术，用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的库尔勒香梨和无病毒实生苗叶片为材料，利用DIG标记，研究了香梨病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括AMV逆转录酶、dNTPs、RNasin及互补引物浓度对cDNA合成的影响，退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg^2＋、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。结果表明：RNasin的用量大于0．2U·μL^-1时，信号强度随着RNasin量的加大而增强；只有当dNTPs浓度达1．0mmol·L^-1时才能生成一定量的cDNA；AMV浓度在0．3-0．5U·μL^-1均可进行正常的逆转录，而且在该范围内产物的量随AMV浓度提高而增多；引物浓度达到0．9μmol·L^-1以上时才能进行有效的逆转录，并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度为56℃。循环20-30次可出现较强的蓝色信号，引物浓度在0．8-1．2μmol·L^-1时显色较好；Taq酶浓度为20U·μL^-1以上，均显示较深的蓝色；Mg^2＋浓度为1．5mmol·L^-1就可满足原位PCR所需。获得了苹果褪绿叶斑病毒的原位PCR优化检测体系，利用建立的优化程序对香梨样品进行了检测验证，取得了很好效果。

侵染云南苹果的苹果褪绿叶斑病毒的RT-PCR检测和序列分析

以云南昭通、昆明、曲靖等地采集的苹果病毒病样品为试材,对其是否携带苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)进行RT-PCR检测,将本试验获得3个云南ACLSV分离物(ZT,ML,TJX)和GenBank上已登录的24个分离物进行序列比对分析。所有的ACLSV分离物的核苷酸序列相似性为81.3%～99.7%,它们可以被分成两大组群,组群A,包括了大部分不同寄主、地理来源的分离物,所有的ACLSV苹果分离物位于组A;组群B,包括了ACLSV全部的寄主为桃的分离物。本研究获得的3个苹果云南分离物属于组群A,组群A可分成两个亚组,其中,分离物ML和TJX位于同一个亚组,而分离物ZT位于另一个亚组。结果表明ACLSV苹果分离物与寄主种类存在一定的相关性,该研究为株系划分、分子流行和寄主抗性分析提供依据。

苹果褪绿叶斑病毒生物学及生化特性研究

对从苹果和扁桃上获得２个苹果褪绿叶斑病毒的分离物ＡＣＬＳＶ－Ｃ和ＡＣＬＳＶ－Ｂ的主要生物学和生化特性进行了比较。人工接种５科１９种草本植物，发现两者均能侵染苋色藜（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、昆诺藜（Ｃｈ．ｑｕｉｎｏａ）和西方烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ），产生局部侵染斑和系统褪绿斑。但症状反应存在差异，后者在这３种植物上引起叶片反卷等较强症状反应，还可潜伏侵染笋瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍａｘｉｍａｃｖ．ＢｕｔｅｒｃｕｐＢｕｒｇｅｓｓ）。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，ＡＣＬＳＶ－Ｂ衣壳蛋白的迁移率较ＡＣＬＳＶ－Ｃ快。两者的ＲＮＡ分子量及双链ＲＮＡ数量无明显差异。根据已报道的核苷酸系列设计合成引物，采用ＰＣＲ法检测ＡＣＬＳＶ分离物，均获得特异性扩增产物。

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的序列分析

利用RT-PCR,获得苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因由582个核苷酸组成,编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的P863、P205、A-Ball分离物序列比较,核苷酸序列同源性为80.0％～86.1％,推导的氨基酸序列同源性为84.9％～89.6％。

库尔勒香梨病毒病多重RT-PCR检测技术研究

在建立PVYV和ACLSVRT PCR优化体系的基础上,主要研究了多重PCR中2套引物的浓度和退火温度的影响,研究表明:多重PCR体系中引物Tm值越高、长度越长浓度就需越高;如果Tm值相差不大,退火温度的确定要以Tm值高的引物为准。应用该体系可以节约成本、缩短时间。

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化。结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率。

苹果褪绿叶斑病毒一步法RT-PCR检测

RT-PCR技术在植物病毒检测方面有着快速、灵敏、特异性强等优点。然而传统的RT-PCR是在两个酶(逆转录酶和Taq酶)分别催化下在两个体系中的两步反应,即由RNA逆转录为cDNA,再以模板cDNA进行PCR扩增,操作步骤比较繁琐,而且很容易造成交叉污染。笔者建立的一步法RT-PCR是在逆转录酶(M-MLV)和Taq DNA聚合酶共同作用下,只需在一个反应管中就可以完成反转录和cDNA扩增的全过程,两个步骤一步完成,以达到对苹果褪绿叶斑病毒快速、简便、敏感的检测。

苹果褪绿叶斑病毒在苹果植株体内的分布

以采自河北农业大学苹果园的褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)样本为试材,采用实时荧光定量RT-PCR方法,研究了苹果不同组织部位、不同树体方位、不同生长发育时期和病毒相对含量之间的关系,以期为明确褪绿叶斑病毒在苹果植株中的时空分布规律提供参考依据。结果表明:从组织部位角度分析,在苹果的盛花期,ACLSV在花中的相对含量最高,芽中最低,ACLSV相对含量由高到低依次为:花、二年生枝皮组织、叶、一年生枝皮组织和芽。从树体方位角度分析,在苹果一年生枝皮组织中,ACLSV在4个方位上的病毒相对含量差异显著,位于南向的病毒相对含量最高,西向最低。从生长发育时期角度进行分析,2015年9月至2016年4月,苹果一年生枝皮组织中,病毒相对含量从9月中旬至10月中旬大幅升高,10月中旬达到这8个月中的最高峰,此后病毒相对含量开始下降,3月起呈上升趋势。

库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将ACLSVCP基因克隆到表达载体pET 28a(+)中,转化大肠杆菌BL21,筛选得到阳性克隆pET ACP,用IPTG诱导使其表达,SDS PAGE电泳分析表明,预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达,并加以纯化,用于制备抗血清。

桃上苹果褪绿叶斑病毒的发生与检测

对山东省果树研究所试验基地‘玉妃’、‘超红’、‘岱妃’三个桃品种的苹果褪绿叶斑病毒病的发生情况进行调查,采集22份样品,利用ACLSV特异性引物进行RT-PCR检测。结果表明,在‘玉妃’桃的叶片中扩增出与苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)预期大小一致的目的片段,并与GenBank登录的病毒核苷酸序列具有较高的一致性,而在‘超红’和‘岱妃’桃中均未检测到该病毒。

自行设计高效RNA提取方法对果树病毒检测效果的研究

目的:建立适合果树病毒检测的高效RNA提取方法。方法:以梨、苹果幼嫩叶片及韧皮部为材料,利用已有的和自行设计的RNA提取方法,研究了苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎痘病毒RT-PCR检测的效果。结果:自行设计的方法能在1h内获得纯度高、含量多、完整性好的总RNA,并能很好地用于RT-PCR扩增,扩增产物经回收、克隆和测序,证实是检测病毒的特异条带。结论:经反复多次实验证实,该方法适合果树RNA的快速提取,操作简便、快捷,可大大缩短RNA的提取时间,降低提取成本,适合大量样品的提取检测,可广泛用于各种果树病毒的研究。

苹果褪绿叶斑病毒PBM1（李假痘）毒株的提纯、抗血清制备及ELISA检测

从木本植物分离的苹果褪绿叶斑病毒（ａｐｐｌｅｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ组）的ＰＢＭ１毒株能引起李品种“Ｈａｕｓｚｗｅｔｓｈｅ”的假痘病，将其繁殖在昆诺藜（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍｑｕｉｎｏａ）上。感染ＰＢＭ１毒株的昆诺藜叶组织用两次蔗糖梯度离心提纯。每１００ｇ叶组织的病毒产量平均为１．６８ｍｇ。在电镜下可观察到弯曲状病毒颗粒上的螺纹结构。通过ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，病毒外壳蛋白的分子量为２１．５ｋＤａ。用提纯的病毒免疫家兔制备的抗血清和ＥＬＩＳＡ法，对感染ＰＢＭ１的昆诺藜叶片和桃花进行了灵敏的检测。