新疆桃树上苹果锈果类病毒(ASSVd)的检测与全序列分析

在以往研究苹果和梨ASSVd的基础上,利用RT-PCR技术对新疆的桃树进行了检测,检测过程中首次发现桃树上有ASSVd类病毒的存在,利用RT-PCR技术分别获得了其全长序列,通过回收克隆测序,发现桃树苹果锈果类病毒基因组长为331 nt,将克隆测序结果在GenBank中登录,获得了桃树上的10条ASSVd的序列登录号为:EU031477～EU031486。为快速鉴定桃树苹果锈果类病毒奠定了良好基础。

新疆苹果树上苹果锈果类病毒(ASSVd)的检测与全序列分析

【目的】检测并分析新疆223团场多年生苹果树上的苹果锈果类病毒。【方法】对采自新疆库尔勒223团的多年生苹果树的枝条、叶片、果实((果皮、种子))样品进行RNA提取,利用RT-PCR技术检测鉴定。【结果】(1)多年生的‘金冠’苹果树上检测到苹果锈果类病毒,得到4条克隆序列(ASSVd Y1:KC110858;ASSVd Y6:KC110859;ASSVd Y8:KC110860;ASSVd Y10:KC110861),所得序列与Gen Bank中已报道的国内外ASSVd序列同源性达85%以上。(2)序列比对可知,4条‘金冠’分离物序列之间只有3个碱基变异,与首次登录生物X17696有26个碱基变异,其中有4个碱基缺失和5个碱基插入,且变异多集中在类病毒序列的TL与TR区。【结论】通过序列分析比对,各寄主上的ASSVd分离物核酸序列变异较小,建立了优化的RT-PCR检测方法,为苹果树ASSVd的快速检测奠定了良好的基础。

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。

苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析

本研究以采自山东省栖霞市的两个苹果样品为试验材料,利用二维电泳、斑点杂交、RT-PCR等分子生物学技术对样品中的苹果锈果类病毒(ASSVd)带毒情况进行了检测。结果表明:两个样品均携带ASSVd。对两个样品中的ASSVd进行克隆测序,并利用生物学软件DNAMAN对所得序列进行分析,结果表明:与世界上首次报道的ASSVd序列(X17696)相比,本研究所得到的ASSVd序列变异较小,相对比较保守。

新疆梨树上苹果锈果类病毒的检测与全序列分析

[目的]检测并分析新疆和静县223团场多年生早熟梨树上的苹果锈果类病毒(ASSVd)。[方法]对采自新疆和静县223团多年生早熟梨的枝条和叶片样品进行RNA抽提,经RT-PCR技术鉴定检测。[结果](1)多年生早熟梨树检测到苹果锈果类病毒,得到2条ASSVd核酸序列(JX861258～JX861259),所得序列与GenBank中已报道的国内外ASSVd序列同源性达86%以上。(2)原位RT-PCR检测进一步表明ASSVd的RNA阳性信号主要位于叶片肉组织的细胞核内。[结论]通过序列分析比对,各寄主上的ASSVd分离物核酸序列变异较小,地域和品种间核酸序列无明显差异。建立了优化的RT-PCR检测及原位RT-PCR检测方法,为果树ASSVd的快速检测奠定了良好的基础。

苹果锈果类病毒新疆分离物的克隆和序列分析

利用自行设计的方法分离提取总RNA,通过一对特异引物,扩增出苹果锈果类病毒的全长片段,该片段通过回收、克隆和测序,结果发现该片段全长330bp,与已发表的NC_001340同源性为99.7%,仅在第126有一个碱基差异。由此证明该片段是苹果锈果类病毒的全长序列,进一步证明该反应体系能很好地用于苹果锈果类病毒的RT-PCR检测,为快速鉴定类病毒奠定了良好基础。

北京平谷区苹果锈果类病毒检测初报

采集北京市平谷区‘中秋王’、‘寒富’苹果叶片样品共12份,以Northern杂交、RT-PCR方法检测苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）带毒情况。结果表明,表现明显锈果症状的‘中秋王’样品均检出ASSVd,无明显症状的‘中秋王’样品没有检出ASSVd,而无明显症状的‘寒富’样品全部携带ASSVd。测序发现,所得序列与NCBI中已报道的ASSVd基因组序列相似性为91%～99%,且两品种中ASSVd主流序列完全相同。结果说明‘中秋王’对ASSVd较为敏感,感病后易于表现出明显的锈果症状;‘寒富’对ASSVd耐性较强,感病后不表现出明显症状。

河北保定地区苹果锈果类病毒分离物的序列分析

以采自河北保定的苹果锈果类病毒（apple skin scar viroid,ASSVd）样本为试材,采用用RT-PCR方法对样本中的ASSVd全基因组序列进行扩增,然后利用生物学软件MEGA 6.0对该分离物与已发表的其它分离物序列构建系统发育树,对系统进化关系进行分析。结果表明：ASSVd保定分离物基因组全长332nt,将序列提交到GenBank,登录号为KR264032。该分离物与已发表的其它13个来自不同寄主、不同国家的ASSVd分离物间进化关系极近,核苷酸相似性为92%~99%。与加拿大苹果上的X71599株系亲缘关系最近,相似性为99%,仅在第221位有一个碱基差异,与新疆梨上的JX861259株系亲缘关系最远。系统发育分析表明,不同地区的ASSVd分离物聚类没有规律性,说明ASSVd不存在地区专化性。新疆梨、桃、杏、苹果不在同一分支,说明ASSVd可能存在一定的寄主特异性。二级结构预测表明,该分离物的中央保守区与末端保守区与ASSVd其它序列相同。

侵染小苹果的苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

小苹果是抗寒海棠类与大苹果的杂交后代,因耐寒能力强,口感好,被广泛用于嫁接与育种材料,是我国寒凉苹果产区宝贵的种质资源。苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)侵染苹果后引起果实表面产生锈状斑、花脸、畸形等症状,严重降低果实品质和市场价值。2013年在调查苹果病毒病时发现北京市延庆县种植的小苹果表现出典型畸形症状,应用RT-PCR方法对其进行检测后经测序和序列分析表明,小苹果被苹果锈果类病毒侵染。克隆此分离物(ASSVd-YQ)全基因组序列,分析后得到其基因组全长为329个核苷酸,系统发育分析表明该分离物与来自不同国家和地区的ASSVd分离物间的进化关系极近。二级结构预测表明,该分离物的中央保守区与末端保守区与ASSVd参考序列相同。这是对侵染小苹果的ASSVd的首次检测和鉴定。

新疆杏树苹果锈果类病毒的检测与全序列分析

在以往研究苹果锈果类病毒（ASSVd）的基础上，以斑点杂交检测ASSVd呈阳性的杏树为试验材料，利用RT-PCR技术扩增出苹果锈果类病毒全长特异片段，通过回收克隆测序，发现杏树苹果锈果类病毒基因组长为330nt，将克隆测序结果在GenBank中登录，获得10条序列，登录号为EU031487-EU031496。在此基础上，利用原位RT-PCR检测技术，进一步证明杏树叶片中有苹果锈果类病毒存在，主要分布在细胞核中。本研究证实苹果锈果类病毒也能侵染杏树。

利用试剂盒快速检测苹果锈果类病毒的研究

为简化苹果锈果类病毒(apple skin scar viroid,ASSVd)的常规RT-PCR检测步骤,找到更为快速准确的检测方法,以感染ASSVd的田间苹果枝条为试验材料,根据基因库中ASSVd的基因序列设计合成特异性引物,选用国产试剂盒,对RT-PCR体系进行优化。结果表明,总RNA和反转录产物的用量分别为37.4～74.8ng、1.0～3.0μL,退火温度为63.8℃,可以获得良好的两步RT-PCR扩增;而总RNA用量为3.74～7.48ng、退火温度在50.1～62.6℃范围内时,一步RT-PCR的扩增效果较好。采用优化的RT-PCR检测体系对山东采集的样品进行检测,2种检测体系的检测结果完全一致。研究建立的两步和一步RT-PCR优化体系为ASSVd的批量快速检测奠定了基础。

5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。

苹果锈果类病毒在7个品种苹果上的分子变异及系统发育关系

【目的】探究不同品种苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)的分子变异及系统发育关系,为进一步揭示ASSVd分子变异机制打下基础。【方法】以富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信侬红和信侬黄7个品种的染病苹果组织为材料,通过特异性引物对ASSVd全基因组序列进行扩增,然后进行分子克隆和序列测定,利用生物学软件DNAMAN对变异序列一致性进行分析并利用生物学软件MEGA构建系统发育树。【结果】共获得210个ASSVd的基因组序列,共计17种变体,大小为325—333 nt。将不同苹果品种获得的17种变体与其他已发表代表性分离物进行分析发现,所有变体被分为3组,组Ⅰ包括10种变体,同已报道的保定富士分离物(KR264032.1)亲缘关系较近;组Ⅱ包括6种变体单独聚类;组Ⅲ包括1种变体,与新疆红富士苹果上的分离物(EU031455.1)亲缘关系较近。进一步根据基因组0—3、221、251、284、302这8个位点的碱基变异,将17种变体分为6种类型:1、nt 0—3(GGTA)+nt 41—46(TAAAAT)+nt 221(T)+nt 251(T)+nt 284(G)+nt 302(T);2、nt 0—3(XGGT)+nt 41—46(AGATAX)+nt 221(T)+nt 251(X)+nt 284(A)+nt 302(A);3、nt 0—3(XGGT)+nt 41—46(AGATAX)+nt 221(X)+nt 251(T)+nt 284(A)+nt 302(A);4、nt 0—3(XGGT/GGTA)+nt 41—46(AGATAX)+nt 221(T)+nt 251(T)+nt 284(A)+nt 302(A);5、nt 0—3(GGTA)+nt 41—46(TAAAAT)+nt 221(X)+nt 251(G)+nt 284(G)+nt 302(T);6、nt 0—3(GGTA)+nt 41—46(TAAAAT)+nt 221(T)+nt 251(G)+nt 284(G)+nt 302(T)。其中X表示缺失。富士品种包含6种变体,以类型4为主(47.5%);王林品种包含3种变体,以类型5为主(43%);金冠包含3种变体,以类型4为主(60%);斗南品种只有1种变体,为类型5,占比100%;中秋王品种只有1种变体,为类型4,占比100%;信侬红包含2种变体,以类型1为主(83.3%);信侬黄包含3种变体,以类型1为主(62.5%)。【结论】根据ASSVd nt 0—3、221、251、284、302这8个位点的碱基变异,将富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信侬红、信侬黄品种中17种变体分为6种类型,不同苹果品种携带的ASSVd种群结构、病毒变体类型及占比均不同。

我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

近年来,由苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重,对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,采用RT-PCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,并克隆获得30个分离物的基因组全序列,大小为330~333个核苷酸。分析表明,这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%~100%,在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守,在致病区和左端区域有突变,一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类,而与地理来源无关。

苹果锈果类病毒火焰海棠分离物全基因组克隆及序列分析

【目的】检测从山东青岛采集的有“花脸”症状的火焰海棠(Malus‘Flame’)果实是否带有苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)。【方法】提取带有“花脸”症状的火焰海棠果皮总RNA,设计ASSVd特异性引物,利用RTPCR方法进行检测。设计基因特异性引物扩增ASSVd基因组全长,并进行克隆、测序,利用CLC RNAWorkbench4预测其二级结构。用DANMAN软件比对来自中国不同地区、不同寄主的苹果锈果类病毒分离物基因序列。用MEGA-7软件分析山东火焰海棠ASSVd分离物与来自不同国家、不同寄主ASSVd分离物的遗传关系。【结果】从山东青岛采集的表现“花脸”症状的火焰海棠果皮中检测到ASSVd,推测火焰海棠果皮的“花脸”症状可能由ASSVd引起。利用基因特异性引物克隆4条ASSVd基因组全长序列,其长度为333~334 bp,在GenBank的登录号依次为MK102981-MK102984。ASSVd序列比对结果显示,来源于不同寄主的分离物存在差异。系统进化树显示ASSVd不存在明显的地区专化性,进一步对ASSVd二级结构分析发现不同寄主的ASSVd致病区(P)存在明显的差异。【结论】从山东青岛采集的带有“花脸”症状的火焰海棠果实带有ASSVd。本研究从火焰海棠检测到ASSVd,明确其为自然寄主之一,且火焰海棠果实的“花脸”症状形成可能与ASSVd侵染有关。

利用内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术

为开发准确、灵敏的苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)RT-PCR检测方法,以田间染病苹果组织为试材,提取高质量总RNA为模板,在常规RT-PCR检测体系中引入苹果线粒体nad5基因作为内标基因,对RT-PCR反应体系和程序进行优化,并测定其灵敏度和稳定性,最后利用优化的检测体系确定苹果果实着色期最佳检测部位。结果表明:以RNA提取改良法提取总RNA为模板合成cDNA后,进行PCR扩增,优化后的PCR体系(25μL)中cDNA模板2μL、ASSVd(20pmol/μL)正反向引物各1.0μL,nad5(20pmol/μL)正反向引物各0.1μL;扩增程序中退火温度为60.9℃,循环次数为35次;检测灵敏度为37.5ng新鲜样本;果实着色期,染病植株的幼嫩叶片、1a生枝的韧皮部和木质部、果实及部分种子样本均能检测到病毒,最佳检测部位为幼嫩韧皮部。研究结果可以为ASSVd高效、快速、准确的检测提供可靠方法,并为田间病害诊断及无毒苗木繁育提供依据和借鉴。

苹果锈果类病毒内蒙古金红分离物的基因组序列分析

【目的】研究苹果锈果类病毒内蒙古金红分离物的基因组序列,为苹果锈果类病毒的有效防控提供参考。【方法】鉴定内蒙古自治区园艺研究院实验农场果实表现花脸的金红苹果叶片是否被苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)侵染。提取植物总RNA并以获得的总RNA为模板合成cDNA第一链,通过RT-PCR技术检测样品中的ASSVd,并经克隆测序获得ASSVd内蒙古金红分离物全基因组序列。采用MEGA 6.0、DNAMAN软件对不同寄主和不同地区来源的ASSVd分离物核苷酸序列进行分析,利用线上工具RNA Folding Form预测ASSVd内蒙古金红分离物的RNA二级结构。【结果】在疑似感病内蒙古金红苹果叶片样品中检测到ASSVd。ASSVd内蒙古金红分离物的序列长度为330 nt(GenBank登录号MZ476527),与ASSVd新疆梨分离物(JX861258)的亲缘关系最近,核苷酸序列一致性也最高,为97.9%;其次与ASSVd内蒙古塞外红苹果分离物(MN598205)的亲缘关系较近,序列一致性为97.0%;与ASSVd内蒙古塞外红苹果分离物(MN598204)的核苷酸一致性最低,为87.5%。系统发育分析显示,ASSVd的遗传关系与寄主和地理来源相关性不大。多重对比分析结果表明,ASSVd的变异主要集中在左末端区、致病区和中央保守区。RNA Folding Form预测ASSVd内蒙古金红分离物RNA基因组具有杆状二级结构,自由能为-499.49 kJ/mol。【结论】内蒙古金红苹果样品被ASSVd侵染,获取了其基因组序列相关信息。

苹果锈果类病毒的温度梯度凝胶电泳

用温度梯度凝胶电泳技术研究了苹果锈果类病毒(ASSV)的变性行为,并与菊花矮化类病毒(CSV)的变性行为进行了比较。提纯的 ASSV 的温度梯度电泳示出了类病毒特有的从类似于棒状的分子到打开的环状分子的构象转变曲线,与 CSV 及报道的马铃薯纺锤块状类病毒(PSTV)相似。但 ASSV 的构象转变中点温度及转变的协同性均低于 CSV。在8.9mol/LTBE 缓冲液中,ASSV 构象转变的中点温度和半辐值分别为41.5℃和2.4℃,而 CSV 的分别为46.0℃和1.0℃。在 ASSV 的温度梯度凝胶电泳图中,除了有代表单分子构象转变的曲线外,还观察到另一构象转变曲线,作者认为这代表了在提纯过程中由分子间碱基配对形成的双分子复合体的变性曲线。

侵染‘舞美’苹果的苹果锈果类病毒检测与全序列分析

2017年9月,在山东胶州调查苹果病毒病时发现‘舞美’果实表现出明显的花脸症状,取发病树体芽组织嫁接于健康‘富士’苹果幼树上,采用RT-PCR技术对其是否含有苹果锈果类病毒进行了检测,并利用DNAMAN、MEGA5.1等软件对其全序列进行了分析。结果表明,显症‘舞美’果实、发病树体枝条及嫁接‘富士’枝条中均可检测出ASSVd,无症状‘舞美’果实和相应树体枝条中均未检测到ASSVd。‘舞美’分离物基因组主流序列为333nt(登录号MG745387),与GenBank中已报道的ASSVd序列一致性为92%~99%。序列多重比对及系统进化树分析发现,该分离物的末端保守区和中央保守区与ASSVd参考序列一致,且与不同来源的ASSVd分离物亲缘关系较近。这是首次在‘舞美’苹果上发现和鉴定出苹果锈果类病毒。

苹果花脸病田间病情发展及ASSVd在组培条件下的传播

为了明确苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)引起的苹果花脸病在田间的病情发展情况以及ASSVd在组培条件下的传播方式,2012—2015年对河北省顺平南神南村3个果园进行持续调查和检测。结果显示,果园A、B、C的显症率分别从3.00%、19.35%和10.00%上升至10.00%、34.41%和22.00%,带毒率分别从11.00%、20.43%和14.00%上升至23.00%、37.63%和30.00%,带毒率和显症率都逐年增加,而且带毒率大于显症率,即有些带毒果树不显症。发病果树田间分布有明显的发病中心。通过高通量测序发现显症果树ASSVd vsiRNA reads数是带毒未显症reads数的4.08倍,同时实时荧光定量PCR检测发现显症树ASSVd病毒积累量显著高于带毒未显症树。以携带ASSVd的组培苗和无毒组培苗为试材,利用RT-PCR检测明确了ASSVd可通过伤口沾染带毒汁液、组培剪污染、含毒培养基、根系接触进行传播,其中根系接触传染率较高。