尿激酶原糖基化对其表达稳定性的研究

目的:探讨尿激酶原糖基化对其表达稳定性的影响。方法:构建非糖基化尿激酶原,收取无血清培养上清为检测标本。用嗜热杆菌金属蛋白酶(thermolysin)激活尿激酶原。用抑肽酶(aprotinin)终止激活反应。生色底物S-2444用于显色反应。在405nm波长处测定分光光度值(OD值)以确定双链成分的比例。在不用thermolysin激活的条件下,用公式计算单链尿激酶原比例。将重组尿激酶原和天然尿激酶原的培养上清置于4℃和37℃。每隔12h测定总活性和单链成分比例。经过阳离子层析和凝胶层析纯化后,测定蛋白产品浓度、活性。SDS-PAGE电泳鉴定蛋白质分子质量和蛋白含量。结果:在37℃下天然尿激酶原(Asn302位带有糖基化侧链)的活性远高于重组尿激酶原(非糖基化)。无论4℃或37℃,糖基化尿激酶原的单链比例均高于非糖基化尿激酶原。纯化后的天然尿激酶原蛋白产品浓度和活性均高于重组尿激酶原。SDS-PAGE提示天然尿激酶原浓度高于重组尿激酶原,分子质量低于重组尿激酶原。结论:较高的温度加速尿激酶原降解。Asn302位的糖基化位点有益于尿激酶原在培养上清中的稳定性。