胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白重组腺病毒载体构建及免疫原性研究

研究旨在构建胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白的复制缺陷型5型腺病毒载体的重组腺病毒。构建包含胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ基因的穿梭质粒pDC316-APXⅡ,并与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E13Cre共转染Hek293细胞,获得了重组腺病毒rAd-APXⅡ,将纯化后的重组腺病毒rAd-APXⅡ肌肉注射小鼠进行免疫原性分析。结果显示,试验成功构建了pDC316-APXⅡ质粒以及包装了rAd-APXⅡ病毒。rAd5-Null组未产生特异的APXⅡIgG抗体;低和高浓度rAd-APXⅡ组均可产生较高的APXⅡIgG抗体,其中高浓度组产生的抗体水平显著高于低浓度组(P<0.05);某疫苗组产生的抗体水平显著高于rAd-APXⅡ低浓度组(P<0.05),但低于rAd-APXⅡ高浓度组(P<0.05)。低、高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体显著高于rAd-Null组(P<0.05);高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组抗体显著高于低浓度rAd-APXⅡ组(P<0.05)。研究表明,rAd-APXⅡ重组腺病毒免疫小鼠能够产生特异性抗体并显示良好的免疫原性。

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立

根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ^-/Amp^r突变株的构建

根据已发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清5型核苷酸序列设计并合成了一对引物,从自行分离的APP菌株PCR扩增apxⅡCA基因,将该片段与pBluescriptSK(+)载体连接,得到质粒pSK CA。另外,从质粒pIC neo中得到的Ampr基因经XbaⅠ酶切消化后,克隆到pSK CA中的XbaⅠ位点,获得了重组转移质粒pSK CAmpr。pSK CAmprDNA通过电转化导入亲本菌,电转化后的产物涂布于TM平板,可获得突变株。提取突变株和亲本菌基因组DNA,用PCR检测含有apxⅡC基因的胸膜肺炎放线杆菌染色体区域。从突变株基因组DNA扩增得到的一条PCRDNA片段比从亲本菌基因组DNA扩增得到的一条DNA片段大1 3kb,增大的片段与所插入的Ampr基因大小相符合。用合成的Ampr基因引物从突变株基因组DNA中也能扩增到一条1 3kb的特异性DNA片段。同时South ernblot鉴定有特异性带。这表明我们所构建的突变株是成功的。测定了突变株的遗传稳定性及突变株对动物的安全性,为进一步研究用其它报告基因置换Ampr基因后,研制单基因工程疫苗及以APP毒力缺失突变菌株为载体,表达外源基因的APP基因工程菌的研究奠定了坚实的基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的特点,建立了一种能够诊断猪传染性胸膜肺炎和进行免疫后效果评估的血清学方法ApxⅡ-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试,与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究,并用该试剂盒检测了来自中国、英国、丹麦、美国、加拿大和澳大利亚的临床猪血清1 453份。结果表明,ApxⅡ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性;3批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均<15%);试剂盒在2～8℃保存9个月,稳定性良好;ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎,同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法。

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ C突变株转移载体pSKPG的构建

通过 PCR方法克隆了胸膜肺炎放线杆菌 ( Actinobacillus pleuropneum oniae)武汉株完整的 apx C基因和部分apx A基因约 3.4 kb。将该 DNA片段克隆到载体 p Bluescript SK( + )中得到质粒 p SKPP,并进一步将 gfp基因插入到 apx C基因的 Xba1 位点处 ,构建了 apx C基因插入失活的转移载体 p SKPG,从而为构建胸膜肺炎放线杆菌apx

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因原核表达载体的构建及其表达

经PCR从含有APXⅡA基因片段的重组质粒 pT APXⅡA中扩增出了APXⅡA基因。同时对目的基因和表达质粒 pGEX 4T 1进行了双酶切 ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析 ,证明连接向位和阅读框架正确。成功构建了APXⅡA基因的原核表达载体 pGEX APXⅡA。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE分析表达目的蛋白。结果表明 ,蛋白质的分子质量为 10 2 .5ku。

重叠片断PCR方法构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ C突变载体pBSCA(-)

通过PCR克隆得到了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型完整的apxⅡC基因和部分apxⅡA基因约2 000 bp,通过重叠片段PCR方法使apxⅡC基因缺失,并将该DNA片段克隆到PBS-T载体中构建了apxⅡC基因失活的转移载体pBSCA(-),为构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型apxⅡC缺失菌株打下基础。

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 7型的DNA提取物中扩增出大小为 2 873bp的APXⅡA基因片段 ;将PCR产物重组到质粒载体 pMD 18 T中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株M 30 6 0 2的同源性达 99.7%。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接ELISA方法的建立(英文)

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。

猪胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中的截短表达

猪胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅡ(Actinobacillus.pleuropneumoniae toxin,Apx)作为亚单位疫苗可较好抵抗养猪业五大疾病之一的猪胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)是食品级安全微生物,疫苗蛋白表达潜力巨大。为实现重组ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中分泌表达,截取全长ApxⅡ中抗原表位序列获得ApxⅡ截短片段(ApxⅡ#5)并将其构建至谷氨酸棒杆菌表达载体pXMJ19中表达。为进一步提升ApxⅡ分泌表达水平,优化ApxⅡ表达盒中启动子和信号肽元件。结果表明,全长ApxⅡ未在谷氨酸棒杆菌中表达,截短ApxⅡ可在其中分泌表达。为进一步提高产量,通过启动子筛选,选用诱导型启动子tac,其表达强度为全合成启动子H36的1.58倍;通过信号肽筛选,选用CspB信号肽,其分泌表达强度为对照组CgR0949信号肽的5.48倍。在谷氨酸棒杆菌中表达截短ApxⅡ摇瓶水平产量达到51.1 mg·L^(-1),可与猪抗ApxⅡ阳性血清特异性免疫。研究结果可为兽用疫苗产业提供质量可靠、低成本表达体系。

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC^-/ GFP^+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB0 3染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC- GFP+ ,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。

胸膜肺炎放线杆菌Apxll毒素的基因序列特征

为了深入地了解胸膜肺炎放线杆菌(APP)分泌的ApxⅡ毒素的分子结构及序列特征,本实验以一株APP 7型现地分离株L25-4株为实验材料,对其分泌的ApXⅡ毒素的结构基因apxⅡA及其上游启动子区进行了PCR扩增和测序。结果表明APP7型L25-4株apxⅡA基因与其它血清型apxⅡA基因核苷酸序列同源性达99．5%以上,氨基酸序列同源性达98．5%以上。在ApxⅡA蛋白的N末端有3个大的疏水结构域,分布在240～422位氨基酸之间。在ApxⅡA蛋白的C末端有富含甘氨酸(Gly)和天门冬氨酸(Asp)的九肽(nonapeptides)重复序列Leu/Ile/Phe-Xaa-Gly-Gly-Xaa-Gly-Asm/Ssp-Asp-Xaa,串连重复9次。这些结构域的起始氨基酸的位置分别为374、503、630、735、753、762、771、780和802。推定的赖氨酸酰基化作用位点为557位氨基酸,与E．coli的HlyA相比,在688位氨基酸处少了一个赖氨酸酰基化作用位点。apxⅡA基因启动子-10区序列为AATAAT,-35区序列为TTAAT,-10区与-35区间隔序列为11个碱基。

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的间接ELISA检测

为了建立快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)抗体的间接ELISA方法,将质粒pET-rApxⅡ转化至BL21,IPTG诱导表达毒素rApxⅡ融合蛋白,经亲和层析纯化后的蛋白作为检测抗原。对ELISA各检测条件进行优化,结果显示,抗原最适包被浓度为10μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80。用建立的ELISA方法对猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪副嗜血杆菌、大肠杆菌阳性血清进行检测,均无交叉反应。利用建立的ELISA方法从172份临床血清样本中检测出84份阳性血清样本,而利用Cps-ELISA试剂盒检测到74份阳性样品,本方法检测总符合率达83%。

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素 基因的质粒 p ET- Apx 转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)。挑选出表达量最高的克隆子 ,于 37℃经 IPTG诱导表达。对表达条件进行优化 ,并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原 ,建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接 EL ISA。试验的最佳反应条件为 :最佳抗原稀释度为 1∶ 1 6 0 ,抗原包被液用 Tris- HCl(p H8.0 ) ,封闭液用含 0 .4 %BSA的 PBST,血清稀释度为 1∶ 4 0 ,二抗稀释度为 1∶ 6 0 0 0 ,稀释液用含0 .4 %BSA的 PBST,血清反应时间为 30 min,二抗反应时间为 4 5 min,底物反应时间为 2 0 m in。与间接血凝 (IHA)检测结果比较 ,建立的 EL ISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性 ,并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接EL ISA对 2 5 0 3份临床送检血清进行了血清流行病学调查 ,结果表明 ,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为 6 3%。

猪胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素研究进展

从分子质量、基因结构及致病机理等方面概述了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素ApxⅠ,ApxⅡ,ApxⅢ和ApxⅣ的基本特点和研究进展。比较并归纳了这4种溶血外毒素的异同点及在15种血清型中存在的特点。

胸膜肺炎放线杆菌3种Apx毒素及外膜蛋白Omp2的原核表达及免疫反应性鉴定

猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。