重组AQP9对L-02细胞脂质沉积的影响

目的构建人水甘油通道蛋白9(aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,验证其在L-02肝细胞中的表达,并检测其对非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型的作用。方法从人肝脏组织中提取总RNA,RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9。将其转染L-02细胞,通过荧光显微镜观察其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9基因在细胞中的表达。通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用。结果成功构建pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并能在L-02细胞中表达,将其转染L-02细胞脂肪变性模型后,油红O染色可见油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高,油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(5.435±0.337)、(2.016±0.144)、(1.485±0.113)mmol/L,而油酸组分别为(3.218±0.220)、(1.538±0.193)、(1.024±0.148)mmol/L,两者之间差异有统计学意义(P<0.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加重。结论 AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病。

AQP9在脑疾病中的研究进展

水甘油通道蛋白-9(AQP9)属于水通道蛋白家族,对水及一些小分子如甘油和尿素具有通透性。论文将集中论述与脑疾病相关的AQP9的最新发现。AQP9表达于星型胶质细胞和儿茶酚胺神经元,脑中AQP9的表达水平受血液中胰岛素浓度的调节,且其在糖尿病病人脑组织中高表达,该研究结果提示AQP9很可能参与脑部能量代谢;中风后AQP9在星型胶质细胞的诱导表达提示它参与细胞外过多乳酸的清除。在某些病理模型中,如全脑缺血或神经胶质瘤中,AQP9在脑中非茶酚胺神经元中也被诱导表达,然而,其功能还尚不明晰。

人水甘油通道蛋白9重组质粒的构建及表达

目的:构建人水甘油通道蛋白9(aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肝脏组织中获得AQP9基因,插入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9,转染COS-7细胞,通过荧光显微镜检测其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9在真核细胞中的表达。结果:PCR及酶切鉴定显示插入人AQP9大小正确。测序鉴定显示,1个碱基发生突变,45位:A→G,为无义突变。通过RT-PCR和Western blot检测到AQP9表达,说明AQP9基因在COS-7细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合,且具有免疫原性。结论:成功构建了pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步研究AQP9在NAFLD发生发展中的作用奠定基础。

清肝化痰活血方对非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠水通道蛋白7、9表达的影响

目的观察清肝化痰活血方对非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠水通道蛋白7、9(AQP-7、9)表达的影响。方法采用高脂饲料喂养复制模型大鼠,第8周分别处死正常组大鼠5只和模型组大鼠10只,模型组剩余大鼠再分为高脂饲料组、易善复组和清肝化痰活血方组,给药5周后,处死大鼠,留取血清、肝组织标本,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)及肝组织中AQP-7、9的表达;另肝组织经HE染色光镜下观察肝组织病理学变化。结果第8周时,模型组大鼠脂肪变性程度和炎症活动度计分与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。第13周时,高脂饲料组大鼠肝细胞脂肪变性和炎症活动度计分与正常组、西药组和中药组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01),肝组织中AQP-7、AQP-9 mRNA的含量与正常组、西药组和中药组相比差异有统计学意义(P<0.01);清肝化痰活血方组大鼠肝组织脂肪变性程度和炎症活动度计分与高脂饲料组比较差异有统计学意义(P<0.05),血清AST、ALT、TG、TC的含量与高脂饲料组比较明显下降(P<0.01),肝组织中AQP-7含量较高脂饲料组明显上升(P<0.01),AQP-9含量较高脂饲料组明显下降(P<0.01)。结论 AQP-7、9与非酒精性脂肪性肝炎的发病有关,清肝化痰活血方可能通过调节AQP-7、9的表达进而改善肝细胞脂质代谢起到防治非酒精性脂肪性肝炎的作用。

水通道蛋白9表达水平影响HepG2肝癌细胞的生物学行为及对As_2O_3的敏感性

目的研究水通道蛋白9(AQP9)表达水平对三氧化二砷(As2O3)诱导Hep G2肝癌细胞凋亡及对其生物学行为的影响。方法采用MTT法筛选As2O3对肝癌细胞Hep G2增殖抑制作用;将重组质粒p EGFP-N1-AQP9和pshRNA-AQP9转染肝癌细胞,反转录PCR检测AQP9 mRNA的表达,Western blot法检测AQP9蛋白表达;将As2O3加入转染后及未处理的Hep G2细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析周期和凋亡情况;TranswellTM实验验证迁移侵袭能力的改变;酶标仪检测caspase-3活性。结果重组质粒对AQP9有明显的过表达及抑制表达作用,转染p EGFP-N1-AQP9组肝癌细胞的增殖抑制作用明显大于单纯As2O3处理组,侵袭及迁移能力显著减弱,细胞周期停滞在G0/G1期,凋亡明显多于单纯As2O3处理组,活化的caspase-3活性最高。转染pshRNA-AQP9组细胞的增殖抑制作用及caspase-3活性小于单纯As2O3处理组,侵袭迁移能力强于单纯As2O3处理组,细胞周期停滞在G0/G1期的数量及凋亡率较少。结论调节AQP9的表达影响Hep G2肝癌细胞的生物学行为并影响As2O3对Hep G2肝癌细胞的敏感性。

水通道蛋白9磷酸化对哺乳动物细胞中砷摄入的影响

目的研究水通道蛋白9(AQP9)mRNA表达水平、水通道蛋白9及p38蛋白表达及其磷酸化水平对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02砷摄入的影响,探讨水通道蛋白9磷酸化的调控机制。方法采用电感藕合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内砷含量。采用实时定量PCR、免疫印迹法和免疫共沉淀技术分别检测不同处理后两细胞株中水通道蛋白9 mRNA、水通道蛋白9和p38蛋白表达水平及其磷酸化水平。采用SPSS统计软件分析实验数据。结果 HepG2细胞内砷含量及摄入速度高于L-02细胞。HepG2细胞的水通道蛋白9 mRNA表达水平在6 h内随NaAsO2处理时间延长而显著增加(P<0.05),而在L-02细胞无明显变化。在2 h时,HepG2细胞水通道蛋白9基因表达水平在各NaAsO2处理浓度均显著增加(P<0.05)。免疫沉淀实验结果显示,HepG2细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化水平随NaAsO2处理时间和浓度的增加而增加,而L-02细胞在各时间和浓度处理点水通道蛋白9蛋白磷酸化水平与对照相比明显增加,但处理间无明显差异;p38的磷酸化水平在两种细胞中均随砷处理时间延长而增加;SB203580抑制p38活性后能完全取消L-02细胞水通道蛋白9蛋白的磷酸化,而对HepG2细胞水通道蛋白9蛋白磷酸化无明显影响。结论水通道蛋白9的表达及磷酸化水平可能在调节细胞砷摄入中发挥重要作用,在不同细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化的调控机制有所差异。