Enhancement of Arachidonic Acid Production by Mortierella isabellina Through Protoplast Regeneration Mutagenesis

A developed method was used for the enhancement of arachidonic acid production by M. isabellina. An orthogonal, rotatable and central composite design was applied to determine the optimum conditions for protoplast regeneration mutagenesis. The results showed that a commixture enzyme （cellulase and glusulase） at the concentration of 4%, enzymolysis temperature at 30℃ and enzymolysis time on 7.5 h were the optimal conditions, in which the lethality of M. isabellina spores was 78.4%. After mutagenesis and re-screenings, M. isabellina mutant Y-69 was obtained. GC analysis showed that the yield of arachidonic acid by Y-69 （2.92 g. L-1） was 3.56 times higher than that of the wild-type strain （0.82 g.L-1）. Pass generation tests showed that the properties of Y-69 by mutation were readily inherited.

Mutagenesis of Arachidonic Acid-producing Mortierella Isabellina and Analyses of Δ~6-desaturase Role by qPCR

Arachidonic acid （AA or ARA）, an essential to-6 polyunsaturated fatty acid （PUFA）, can be produced by Mortierella isabellina. Mutagenesis on Mortierella isabellina As3.3410 was induced to raise ARA production. The mutant strain of YZ-124 had the highest ARA of 4.72 g. L-1, which was 5.5 times higher than that of the original strain 3.3410. mRNA expression level of △ 6- desaturase was determined in five different kinds of ARA-producing Mortierella isabellina after cultured for 7 days, and in the mutant strain YZ-124 over a 3-8 day time-course. In addition, the desaturase activity and ARA content were measured at the selected time points. The lowest expression of △6-desaturase was observed in the original strain and the highest expression in the mutant strain YZ-124, which increased with increasing time in culture. Furthermore, a positive correlation was observed between the expression levels of △6-desaturase and ARA content. Based on this, △6-desaturase played a significant role in ARA synthesis pathway in Mortierella isabellina.

深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的微波诱变育种

为获得生长活力较强、产ARA能力强的菌株,以干菌重、微生物油脂产量和花生四烯酸(ARA)产量为评价指标,采用两轮微波诱变的方法,利用单因素试验确定微波累计加热时间,并采用气相色谱分析ARA含量。试验结果表明:微波频率为高档,累计加热时间为35 s,其致死率为78.3%。经过两轮微波诱变及菌种筛选,获得一株高产菌株W35s2-153,其生物量为30.85 g/L,总油脂含量为15.5 g/L,ARA质量浓度为2.61 g/L,ARA产量比原始对照菌株提高3.18倍,并且遗传性能稳定。

YAG激光照射对高山被孢霉花生四烯酸产量的影响

花生四烯酸产生菌高山被孢霉的孢子在时间为 8m in,距离为 10 cm的 YAG激光剂量照射下 ,其致死率为 75 %～ 80 %。以该剂量反复进行照射及菌种筛选 ,得到其最高生物量 2 8. 6 g/L,油脂 11. 0 4 g/L,AA3. 10 g/L 的突变株 T1 0 5,比对照菌株的 AA产量及油脂量分别提高了 2 . 95倍和 1. 71倍。通过对突变株 T1 0 5的形态、代谢情况以及继代稳定性进行分析 ,认为 YAG激光诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法。

UV、LiCl复合诱变深黄被孢霉选育多不饱和脂肪酸高产菌株

以深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)AS3.2793为出发菌株,利用紫外线和LiCl复合诱变处理,反复多次,最终选育出一支突变株MUI0310。其摇瓶发酵8d时,生物量和总脂含量分别达21.80g/L,61.47%,在同等条件下比出发菌株分别提高了107.62%和5.50%,气相色谱分析其油脂组成,多不饱和脂肪酸含量为23.21%。连续传代多次,其产量性状无显著变化。发酵实验表明菌株MUI0310极有潜力改良成为工业化生产菌种。

深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的紫外诱变原生质体育种

【目的】为了获得一株生长活力较强,产花生四烯酸能力强的菌株。【方法】我们以干菌重、微生物油脂产量和花生四烯酸产量为评价指标,采用紫外线诱变原生质体的方法。我们利用单因素实验确定了紫外线诱变剂量,并采用气相色谱分析了花生四烯酸含量。【结果】试验结果表明:紫外灯功率20 W,照射距离30cm,照射时间40 s,其致死率为79.5%。【结论】经过诱变及菌种筛选所获得高产菌株YZ-124的生物量为36.5 g/L,微生物油脂含量为19.2 g/L,花生四烯酸含量为4.72 g/L,花生四烯酸产量比出发菌株AS3.3410提高576%,并且遗传性能稳定。

花生四烯酸产生菌的选育

通过对深黄被孢霉AS3.2793和MUI0310进行紫外线和氯化锂复合诱变、以及硫酸二乙酯和氯化锂复合诱变,涂布在诱变培养基上,对分离出的突变株进行摇瓶发酵初筛,从中得到一支产花生四烯酸的菌株。该菌株在摇瓶产脂培养基中发酵8天:生物量达16.57g/l,油脂含量达49.10%,油脂得率达8.14g/l,油脂中花生四烯酸的含量为0.9%.

花生四烯酸油脂高产菌株的选育

以高山被孢霉为出发菌株,抗氧化剂——没食子酸辛酯为筛选剂,经过紫外-LiCl复合诱变处理,筛选出抗脂肪酸脱氢酶抑制剂的菌株。将筛选出的菌株经过摇瓶发酵复筛,筛选到1株生产性能优于出发菌株的突变株R807。与原始菌株相比,该菌株的油脂组成脂肪酸分布中C18系列脂肪酸相对较少,花生四烯酸(ARA)占总脂肪酸的含量保持在40%(质量分数)以上。其菌体生物量达到39.2 g/L,油脂产量达到16.3 g/L,ARA占总脂肪酸含量为41.72%(质量分数),ARA产量达6.81 g/L。各数值比原始菌株分别提高了22.9%、3.2%、35.1%和39.8%。连续传代多次,其产量性状无显著变化。

花生四烯酸高产菌株的选育

本研究以一株能产生花生四烯酸的被孢霉菌（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌａｓｐ．）为出发菌株，通过紫外线诱变筛选出一株高产花生四烯酸的突变株Ｍ１０，发酵试验结果表明：突变株Ｍ１０的每升培养液中干菌体得率为３１ｇ，油脂含量为８．３ｇ，而原菌株仅为２０．３ｇ和５．４ｇ，气相色谱分析结果Ｍ１０所产花生四烯酸的量占总脂的１０．０６％（０．８３ｇ／Ｌ培养液）。

深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺研究

在单因素试验基础上,采用响应面分析法优化深黄被孢霉突变菌株发酵制备花生四烯酸工艺,确定最优发酵工艺条件为:接种量15.66%,发酵温度28.29℃,发酵时间6.58 d,发酵p H 5.96。花生四烯酸产量为3.12 g·L-1,在最优发酵工艺条件下,可提高产量,同时减少接种量,缩短发酵时间,降低生产成本。

高产花生四烯酸高山被孢霉的诱变育种研究

通过菌种选育获得具有优良产脂性能的菌株是实现微生物油脂工业化生产的重要前提。利用实验室前期构建的产油丝状真菌快速筛选技术,以前期筛选获得的一株性状优良的高山被孢霉TSM-3为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变方法得到能够稳定遗传的高产突变菌株TSM-3-1,其油脂产量和花生四烯酸(AA)产量分别达到5.07 g/L和1.55 g/L,与出发菌株相比分别提高了47.81%和84.52%。将产油丝状真菌快速筛选技术与诱变育种相结合,提高了目标菌株筛选效率并强化了野生型菌株油脂合成能力,为产油丝状真菌菌种选育提供了新颖的研究思路及方法。

高产花生四烯酸高山被孢霉菌株的诱变筛选

以高山被孢霉(Mortierella alpina)CFCC 88447为出发菌株,利用紫外线-氯化锂复合诱变、硫酸二乙酯化学诱变、微波诱变等方式对出发菌株进行诱变育种,结果表明紫外线-氯化锂复合诱变和硫酸二乙酯化学诱变有利于筛选高产花生四烯酸的菌株。将诱变后的菌株依次通过乙酰水杨酸平板、碘乙酸平板、10℃低温培养、红四氮唑(TTC)水溶液显色、摇瓶发酵等条件进行筛选,最终获得花生四烯酸的高产菌株M-TY-Ⅲ2,其生物量为30.21 g/L,总油脂含量为13.19 g/L,花生四烯酸产量为3.81 g/L,花生四烯酸产量比出发菌株提高了141%。传代实验表明,高产菌株M-TY-Ⅲ2具有良好的遗传稳定性。

响应面法优化深黄被孢霉发酵生产花生四烯酸的培养基条件

为了降低深黄被孢霉YZ-124生产花生四烯酸的成本,研究了不同添加量的玉米黄浆水对发酵的影响,与葡萄糖培养基相比,在发酵培养基中添加一定量的玉米黄浆水对发酵产量无显著影响。在单因素实验的基础上,利用Design Expert设计了响应面实验,研究了葡萄糖浓度、不同添加量的玉米黄浆水和初始pH对花生四烯酸产量的影响。结果表明,最佳的培养基条件是葡萄糖浓度为90g/L、添加体积分数为25%的玉米黄浆水、初始pH6时,花生四烯酸(ARA)产量达到最大,为3.11g/L。

响应面法优化深黄被孢酶发酵生产花生四烯酸的培养条件

采用响应面法对深黄被孢霉发酵生产花生四烯酸的培养条件进行优化。在单因素试验基础上,利用DesignExpert设计了响应面试验,研究培养时间、培养温度、接种量对花生四烯酸产量的影响。结果表明,最佳的培养条件为培养温度28℃,培养时间为7 d,接种量为20%,在此条件下ARA产量为2.42 g/L,实测结果与响应面拟合所得方程的预测值符合良好。

深黄被孢霉高产花生四烯酸差异表达基因的鉴定及序列分析

为了分析不同花生四烯酸产量深黄被孢霉的差异表达基因与花生四烯酸含量的相关性,利用前期构建的不同花生四烯酸产量的深黄被孢霉消减cDNA文库,并采用反向斑点杂交技术,对该文库进行差异表达基因的鉴定,同时对鉴定的差异表达基因进行分析。结果获得了诱变前后深黄被孢霉的差异表达基因共55个。对55个阳性克隆进行测序和序列分析,结果显示25个基因在深黄被孢霉诱变前后差异表达,其中22个基因是霉菌或其他真菌基因的已知序列,其他3个基因无明显的相似序列。这些差异表达基因的鉴定可能与花生四烯酸的产生密切相关,这为进一步探讨深黄被孢霉生产花生四烯酸的分子机理研究提供一定的参考。

利用玉米黄浆水生产花生四烯酸培养条件的研究

为了提高深黄被孢霉YZ-124产业化生产花生四烯酸的产量,研究不同发酵温度、发酵时间和补料方式对发酵的影响。在单因素试验的基础上,利用正交试验对培养条件进行优化,结果表明最佳发酵条件为发酵罐温度28℃,发酵时间7 d,采用50%的分批补料方式,此条件下花生四烯酸产量达到最大,为3.22 g/L。

紫外线诱变深黄被孢霉选育花生四烯酸高产菌株

为获得生长活力较强,产花生四烯酸能力强的菌株,以微生物油脂产量和花生四烯酸产量为评价指标,采用2轮紫外线诱变的方法,利用单因素试验确定紫外线照射时间,并采用气相色谱分析花生四烯酸含量。试验结果表明:紫外灯功率20W,照射距离30cm,照射时间80s,其致死率为76.4%。经过诱变及菌种筛选,获得1株高产菌株Z80s2-109,其总油脂含量为16g/L,花生四烯酸产量为2.34g/L,花生四烯酸产量比原始对照菌株提高377%,并且遗传性能稳定。

花生四烯酸高产菌株的诱变和筛选研究

目的:选育生产性能比出发菌株显著提高的突变株。方法:用微波和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对由轮梗霉制备的原生质体进行诱变育种,然后采用抗失水苹果酰肼与抗低温(15℃)相结合的方法,通过花生四烯酸产量的对比进行筛选。结果:得到一目的菌株,通过摇瓶发酵,结果生物量、油脂产量和花生四烯酸产量分别达到12.252、4.307g/L和257.557mg/L,分别比对照提高了24.96%、56.39%和193.924%。结论:通过突变株的脂肪酸组分分析,认为多轮诱变对于脂肪酸生产菌是有效的育种手段。